增強UV-B輻射對擬南芥fas1突變體的影響

李婷 韓榕

摘要 隨著臭氧層的變薄和臭氧空洞的出現，到達地球表面的 UV-B 輻射明顯提高，對生物的生長和發育產生了一定的影響。擬南芥中fas1同源物的敲除也沒有使其出現致死表型， 植物仍然能夠存活， 只是在胚后器官發生時出現缺陷， 如激活其頂端分生組織處的沉默基因， 導致莖干寬扁， 相應的葉序和花序結構紊亂。因此， fas1能夠穩定異染色質， 使其中的基因保持沉默。以野生型和fas1 突變體擬南芥為材料，對比了不同條件下野生型和 fas1突變體擬南芥的發芽勢和發芽率、根長以及根尖分生區有絲分裂細胞的末期，結果表明在正常生長條件下WT和 fas1 突變體的發芽勢和發芽率、根長以及根尖分生區細胞在有絲分裂末期的形態都沒有顯著差異。而在 UV-B 輻射條件下，對比不同組之間的發芽勢和發芽率、根長，結果表明，WT+UV-B 組低于 WT 組，fas1+UV-B 組低于fas1組，fas1+UV-B 組低于 WT+UV-B 組，且差異均達到顯著水平。此外，在UV-B 輻射條件下，觀察到在 fas1+UV-B 組中，有絲分裂也表現出一定的異常現象。這些結果表明，fas1基因功能的缺失可能是導致fas1 突變體對 UV-B 脅迫敏感的誘因之一。

關鍵詞 UV-B;fas1;擬南芥

中圖分類號 Q947.9 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0001-04

Abstract With the thinning of the ozone layer and the emergence of ozone holes， the UVB radiation reaching the Earths surface is significantly increased， which has a certain impact on the growth and development of organisms. The knockout of the fas1 homolog in Arabidopsis thaliana did not cause a lethal phenotype， and the plant was still alive， only when the postembryonic organ developed defects， such as activation of the silencing gene at its apical meristem， resulting in stem wide and flat， the corresponding leaf order and inflorescence structure were disordered. Therefore， fas1 was able to stabilize heterochromatin and kept the genes in silent. In this paper， the wildtype and fas1 mutants A.thaliana were used as experimental materials to compare the germination potential and germination rate， root length and the terminal phase of mitotic cells in the wildtype and fas1 mutant A.thaliana under different conditions. The results showed that there was no significant difference in germination potential，germination rate， root length and morphology of apical meristem cells at the end of mitosis under normal growth conditions. Under UVB radiation conditions， the germination potential，germination rate and root length between different groups were compared. The results showed that the WT+UVB group was lower than the WT group， the fas1+UVB group was lower than the fas1 group，the fas1+UVB group was lower than the WT+UVB group，the differences reached a significant level. In addition， under UVB radiation conditions， it was observed that mitosis also showed some anomalies in the fas1+UVB group. These results suggested that the loss of fas1 gene function may be one of the incentives for fas1 mutants to be sensitive to UVB stress.

Key words UVB;fas1;Arabidopsis thaliana

太陽光是地球能量的主要來源，而大氣平流層中的臭氧層可以吸收太陽光中的紫外線。20世紀以來，由于排放到大氣中的氯氟烴以及其他氮化物（如N2O等）增加，引起臭氧層的破壞，已成為人類面臨的重大環境問題之一。臭氧層變薄及臭氧空洞的出現[1]，導致到達地面的太陽紫外線輻射增強;且平流層中O3每減少1%，到達地面的太陽紫外線輻射增加2%[2]。太陽紫外線（ultraviolet，UV）按波長大小分為3種：UV-A（315～400 nm）、UV-B（280～315 nm）以及UV-C（100～280 nm）。由于臭氧層變薄，因而到達地面的UV-B輻射增強，會危害陸地植物。盡管UV-B是太陽光中最少的成分，其在到達地表的光中占不到0.5%，但它是太陽光光譜中能量最高的，對生物有十分重要的影響[3]。

在植物利用太陽光進行光合作用的同時，它們也經受UV-B輻射的增強，這種能量輻射對植物形態學建成、生理及物質代謝、細胞骨架和細胞周期都有重要影響。增強UV-B輻射后，小麥幼苗葉片和根中微管蛋白含量減少，根尖細胞中微管周期雖然存在，但其結構紊亂，紡錘體微管損傷嚴重影響染色體與紡錘體的結合，干擾染色體的遷移等;此外，在根尖細胞有絲分裂末期分裂異常，出現多核細胞，這可能與形成細胞板的成膜體微管異常相關[4]。增強UV-B輻射還導致擬南芥葉片變黃，葉片表面積減小，葉片邊緣卷曲;根長的生長已受到抑制[5]。在其他研究中還發現，增強UV-B輻射可以導致不同類型的DNA損傷，如形成嘧啶二聚體（CPDs）、6-4光產物等，進而表現為染色體的異常分裂[6]。UV-B輻射會影響植物的生長發育、生理生化過程以至整個地球生態系統，并造成農作物減產[7]。目前，國內外對紫外線增強后植物的響應及其分子機理研究不斷深入，研究材料主要有大豆[8]、小麥[9]、水稻、玉米[10]等重要經濟（糧食）作物及其他植物。研究發現UV-B輻射增加將會對植物的生長發育產生一定的影響[11-13]。

染色質組裝因子1（chromatinassembly factor 1，CAF-1） 最先是從人類細胞中分離而來的，它由p150、 p60和 p48 這3個亞基組成， 在進化上高度保守，廣泛存在于從酵母到人類等各種生物體中[14-16]。 在DNA 復制和修復過程中， CAF-1 三聚復合體可使組蛋白 H3和H4 沉積到新合成的 DNA 上。目前， 在體外系統中有關 CAF-1 在染色質組裝時的功能研究有較多報道， 但其在體內對生物發育過程影響的相關研究較少。酵母中的CAF-1 由 CAC1（chromatin assembly complex 1）、CAC2 和 CAC3 組成。研究表明，CAC基因并不影響酵母的存活， 但是其中任何一個基因的缺失都會增加酵母對紫外輻射的敏感性， 且會激活端粒 DNA 側翼基因， 使其不再沉默。 在擬南芥中， CAF-1 的同源蛋白質有 FAS1（fasciata 1）、FAS2和 MSI1（multicopy suppressor of IRA1）。與酵母中的研究結果相似， 擬南芥中 CAF-1 同源物的敲除也沒有使其出現致死表型， 植物仍然能夠存活， 只是在胚后器官發生時出現缺陷， 如激活其頂端分生組織處的沉默基因， 導致莖干寬扁， 相應的葉序和花序結構紊亂。因此， CAF-1 能夠穩定異染色質， 使其中的基因保持沉默[17]。

在酵母和擬南芥中， CAF-1 敲除都沒有導致植物出現致死表型的現象， 似乎說明 CAF-1 對于真核生物的發育并非必不可少。然而， 近期對動物的研究卻表明， CAF-1 對動物的發育是必需的。 果蠅中，去除果蠅 dCAF-1 的最大亞基 p180， 導致突變體發育至幼蟲期后死亡， 去除母型 dCAF-1 p180 的活性導致卵子發生受阻。進一步研究發現， dCAF-1 對于果蠅幼蟲的核內周期（endocycle）是必需的[17]。 在斑馬魚中， CAF-1 的中等亞基 CAF-1b 的活性降低， 導致細胞周期進程和細胞分化異常以及某些器官發育障礙， 特別是視網膜、頂蓋、胸鰭和頭骨等的發育出現缺陷。視網膜前體細胞停滯在細胞周期的 S 期， 之后這些細胞發生凋亡。由于降低 P53基因的活性可以挽救細胞凋亡但不能挽救細胞分化的缺陷， 因此， CAF-1 的活性對于這些器官中細胞周期的進程和分化起著非常重要的作用。爪蟾 p150活性的降低使得胚胎發育停滯在中囊胚過渡（MBT）之前， 表現為細胞周期進程異常， 說明其對 MBT 之前快速細胞周期的正常進程是必要的[17]。對哺乳動物小鼠的研究表明， 去除 CAF-1 p150 的純合突變體胚胎發育停止于 16-細胞期， 其中組成型異染色質的組織結構嚴重改變。因此， CAF-1 對于細胞核中染色體建立正確的空間結構是必需的。

筆者在增強UV-B輻射條件下，以擬南芥野生型Col0和突變體fas1為材料，通過分析發芽率、根長、RT-PCR、根尖分生區有絲分裂，以期探討fas1基因在擬南芥有絲分裂過程中的功能，為fas1在有絲分裂過程中的機制研究提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料 野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia ecotype）為植物分子與環境脅迫響應山西省高校重點實驗室保存。fas1（At1G65470）基因的T-DNA插入突變體fas1，編號為Salk_09467，購自擬南芥資源中心NASC。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的培養。

將擬南芥種子放到離心管中，加適量純凈水，4 ℃冰箱中避光春化3 d后，用1%的NaClO溶液消毒12 min，用無菌水沖洗5次，每次1 min;向離心管中加入0.1%瓊脂水使種子懸浮并點種在滅過菌的1/2 MS固體培養基上（2.37 g/L MS 固體粉末，1.5%蔗糖，0.8%瓊脂，pH 58～6.0）。對照組轉到22 ℃/18 ℃（光照/黑暗）、16 h光照/8 h黑暗，光照強度6 000～8 000 lx 的環境中培養 7 d ;UV-B脅迫處理組，參見文獻[14]的方法，具體如下：取正常培養的Col-0和eb1c植株為材料，從點種后第1天開始，轉移到紫外燈泡下，每天08：00～10：00在固定計量[2 W/（m2·d）]的紫外強度下處理2 h，其余時間與對照組處理相同。

1.2.2 DNA水平鑒定擬南芥fas1突變體植株。

取擬南芥基部1 cm2大小的健康葉片3～5片，液氮研磨。加400 μL Extraction Buffer混勻，65 ℃溫育10 min。加150 μL KAC（3 mol/L，pH4.8），混勻，冰浴20 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，取上清到新離心管。加等體積異丙醇，約400 μL，混勻數次，立即室溫14 000 r/min 離心5 min，棄上清留沉淀。沉淀用75%乙醇清洗，室溫14 000 r/min 離心5 min，棄上清，倒扣，晾干。加30 μL ddH2O溶解所提DNA。

根據http：//signal.Salk.edu/tdnaprimers.2.html網站上查到 Salk_009467的 T-DNA 插入位點信息， 設計基因特異引物fas1-LP和fas1-RP與T-DNA的LBa1.3，引物序列見表1。以基因組DNA為模板，分別以fas1-LP/fas1-RP和LBa1.3/fas1-RP為引物，以Col-0野生型和突變體擬南芥基因組DNA為模板，進行PCR擴增。采用 Easy Taq DNA 聚合酶擴增，擴增體系為20 μL：Taq DNA聚合酶0.1 μL、5×Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL、10 μmol/L? fas1-LP/fas1-RP和fas1-RP/LBa1.3各4 μL、模板1 μL、ddH2O 7.3 μL。PCR反應條件為 98 ℃預變性2 min;98 ℃ 10 s，58.8 ℃ 30 s，72? ℃ 1? min 10 s，35個循環后72 ℃延伸10 min，PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的條帶。

1.2.3 RNA水平鑒定擬南芥fas1突變體植株。

采用Trizol法提取擬南芥RNA，具體如下：稱取0.1 g擬南芥葉片，液氮研磨，放入1.5 mL的離心管中，加入1 mL Trizol，劇烈振蕩15 s，靜置10 min。加入預冷的氯仿200 μL，劇烈振蕩15 s，靜置5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，液體分3層，取最上面一層，加等體積預冷的異丙醇。4 ℃冰箱放置30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，留白色膠狀沉淀。沉淀用預冷的75%乙醇清洗2次，每次2 min，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min。加入30～40 μL的DEPC處理水溶解，并對初步提取的RNA用NanoDrop測量濃度并跑膠。取20～50 μg 進行純化處理后加30～40 μL的DEPC處理水溶解，并用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。以目的基因fas1擴增引物fas1-FP和fas1-RP為RT-PCR的引物，以擬南芥actin基因為內參基因，用PrimeSTAR高保真酶進行擴增。擴增體系為20 μL： PrimeSTAR 10 μL、fas1-FP/fas1-RP各1 μL、模 板 1 μL、ddH2O 7 μL。PCR反應條件為98 ℃預變性2 min;98 ℃ 10 s，58.8 ℃ 5 s，72 ℃ 2 mim 30 s，35個循環后72 ℃延伸10 min，PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的條帶。

1.2.4 擬南芥種子發芽勢和發芽率的統計。

種子萌發的測定方法參照宋松泉等[18]進行。具體方法如下：將擬南芥種子點種在1/2MS培養基上，從第2天開始， 每24 h統計1次種子萌發情況。每組各統計100粒， 連續統計5 d，試驗重復3次。第3天計算各組發芽勢， 第6天計算各組發芽率，分別按以下公式進行計算：

發芽勢（Ge）=（前3 d內供試種子的發芽數/供試種子總數）×100%

發芽率（Gr）=（前6 d內供試種子的發芽數/供試種子總數）×100%

2 結果與分析

2.1 擬南芥fas1突變體植株的鑒定 由圖1可知，fas1定位于擬南芥基因組的第 Ⅰ 號染色體上，由11個外顯子和10個內含子組成。根據TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）提供的信息，fas1突變體的T-DNA的插入位點在第5個內含子上，并設計合適的引物。

圖2a為fas1突變體的DNA水平鑒定的PCR結果，1、2、

3號植株為待鑒定的突變體植株，4號植株為野生型。1、2、3

號植株分別用fas1-LP/fas1-RP引物未擴增出目的條帶，如圖2 a 1、3、5所示;同時用T-DNA 邊界引物 LBa1.3/fas1-RP均擴增出目的片段，如圖2 a 2、4、6所示，表明有T-DNA 插入。4號植株為野生型（WT）植株對照，用 fas1-LP/fas1-RP引物有擴增條帶，如圖2 a 7所示;而T-DNA邊界引物LBa13/fas1-RP未擴增出條帶，如圖2 a 8所示，表明沒有T-DNA插入。初步表明3株苗均為fas1突變體T-DNA插入純合突變體。

圖2b為fas1突變體的RNA水平鑒定的PCR結果，1號植株為野生型，2號植株為待鑒定的fas1突變體植株。用內參基因actin的引物擴增時，1號和2號植株結果一致，均有目的條帶，如圖2 b 1、2所示。而用fas1-LP/fas1-RP引物擴增時，1號植株擴增出2 448 bp的fas1條帶，2號植株未擴增出目的條帶，如圖2 b 3、4所示，表明2號植株有 T-DNA插入，而1號野生型擬南芥沒有 T-DNA 插入。進一步確定4號植株為fas1突變體純合植株。

2.2 UV-B處理對擬南芥發芽率和發芽勢的影響

UV-B輻射處理對擬南芥種子萌發的影響結果見表2。從表2可以看出，fas1組擬南芥的發芽勢和發芽率均低于對照組WT，分別降低了1.33%和0.66%，但是都沒有達到顯著水平（P>0.05）。在UV-B輻射條件下，WT+UV-B組擬南芥的發芽勢和發芽率都低于WT組，分別降低了12.62%和8.96%，而且都達到了顯著水平（P<0.05）;fas1+UV-B組擬南芥的發芽勢和發芽率都低于fas1組，分別降低了15.32%和10.01%，且都達到了顯著水平（P<0.05）;fas1+UV-B組擬南芥的發芽勢和發芽率都低于WT+UV-B組，分別降低了4.37%和1.80%，且都達到了顯著水平（P<0.05）。由此可知，UV-B輻射對fas1突變體發芽勢和發芽率的影響大于對野生型擬南芥的影響。

2.3 UV-B處理對擬南芥根長的影響

UV-B輻射處理對擬南芥根長的影響結果如圖3所示，在正常生長條件下，WT和fas1突變體擬南芥的根長差異不顯著（P>0.05）。在UV-B輻射條件下，WT+UV-B根長低于WT組，且差異顯著（P<0.05）;fas1+UV-B組擬南芥的根長低于fas1組，且達到了顯著水平;而fas1+UV-B組與WT+UV-B組的根長有差異，且達到了顯著水平。由此可知，UV-B輻射對擬南芥fas1突變體根長的影響大于對野生型擬南芥根長的影響。

2.4 UV-B處理對擬南芥根尖有絲分裂的影響

為了對UV-B輻射條件下fas1突變體的根尖有絲分裂進行觀察，對fas1突變體植株和野生型植株根尖進行DAPI染色，使用激光共聚焦觀察根尖分生區細胞的有絲分裂（圖4）。結果發現在擬南芥fas1突變體根尖分生區細胞中都有疑似異常有絲分裂現象的發生。

3 討論

在面對惡劣的生長環境時， 固著生長的陸生植物不能像動物那樣通過逃離來保護自己，因此它們進化出精細、有效的機制來抵抗和適應外界各種各樣的逆境脅迫刺激。部分或全部的生長抑制是植物對極端環境的一種適應[19]。很多與生長發育相關的重要功能基因往往也參與逆境脅迫響應及適應過程中的生長調整過程， fas1就是這樣一個參與細胞有絲分裂過程的重要功能基因。對fas1突變體在UV-B脅迫下表型分析和觀察根尖分生區異常有絲分裂表明，fas1基因在擬南芥發育過程中參與了UV-B脅迫反應。

首先通過DNA和RNA水平鑒定擬南芥fas1突變體表明，與野生型相比，fas1突變體中FAS1蛋白的表達量明顯低于野生型。在UV-B脅迫條件下，fas1突變體擬南芥種子的發芽率和根長均低于野生型。之前的報道稱，當輻射劑量高于1.0 kJ/m2時，擬南芥種子的發芽勢、發芽率和株高、根長均受到抑制[20]。因此，fas1基因在擬南芥萌發和幼苗生長階段有重要作用。

該研究發現，在UV-B脅迫條件下，與野生型相比，擬南芥fas1突變體根尖分生區有絲分裂表現為微核和不均等分裂。而之前有報道稱，在植物fas1突變體中，根有肉眼可見的彎曲表型，且在有絲分裂后期呈現落后染色體。因此，fas1在擬南芥根尖分生區的有絲分裂過程中具有重要作用。

然而對fas1在植物染色體分離過程中的具體作用卻知之甚少。與此同時，fas1在UV-B條件下的功能以及fas1如何參與調節UV-B條件下染色體的分離還需要進一步的研究。

參考文獻

[1]

FARMAN J C， GARDINER B G， SHANKLIN J D. Large losses of total ozone in Antarctica reveal seasonal CIOx/NOx interaction[J].Nature，1985，315：207-210.

[2] SCOTTO J，COTTON G，URBACH F，et al. Biologically effective ultraviolet radiation：Surface measurements in the United States，1974 to 1985[J].Science，1988，239（4841）：762-764.

[3] 陳慧澤， 韓榕. 植物響應UV-B輻射的研究進展[J]. 植物學報， 2015， 50（6）：790-801.

[4] 郭愛華. He-Ne激光和增強UV-B輻射對小麥幼苗微管蛋白及微管骨架的影響[D].臨汾：山西師范大學，2010.

[5] 韓雯， 韓榕. 不同時間的UV-B輻射對擬南芥幼苗生長的影響[J]. 植物學報，2015，50（1）：40-46.

[6] 韓榕. He-Ne激光對小麥增強UV-B輻射損傷的修復效應及機理[D]. 西安：西北大學，2002.

[7] TERAMURA A H，SULLIVAN J H，LYDON J.Effect of UVB radiation on soybean yield and seed quality：A 6year field study [J]. Physiol Plant， 1990，80（1）：5-11.

[8] TERAMURA A H.Effects of ultravioletB irradiances on soybean[J].Plant Physiol，1980，65：483-488.

[9] 孫林，黃海山，趙秀勇，等.? UV-B輻射增強對冬小麥生長發育及產量的影響[J].? 農村生態環境，2004，20（2）：24-27.

[10] NOGUO S，ALLEN D J，MORISON J I L，et al.Characterization of stomatal closure caused by ultravioletB radiation[J]. Plant physiology，1999， 121（2）：489-496.

[11] 吳杏春，林文雄，郭玉春，等.植物對 UV-B 輻射增強響應的研究進展[J].中國生態農業學報， 2001，9（3）：52-55.

[12] TEVINI M，TERAMURA A H.UVB effects on terrestrial plant[J]. Photochem and Photobiol，1989，50（4）：479-487.

[13] TERAMURA A H.Effects of ultravioletB radiation on the growth and yield of crop plants[J]. Physiol Plant， 1983，58（3）：415-427.

[14] SMITH S， STILLMAN B. Purification and characterization of CAF1， a human cell factor required for chromatin assembly during DNA replication in vitro[J]. Cell， 1989， 58（1）：15-25.

[15] KAUFMAN P D， KOBAYASHI R， STILLMAN B. Ultraviolet radiation sensitivity and reduction of telomeric? silencing in Saccharomyces cerevisiae cells lacking chromatin assembly factor1[J]. Genes Dev， 1997， 11（3）： 345-357.

[16] FISCHER S， PRYKHOZHIJ S， RAU M J，et al.Mutation of zebrafish caf1b results in S phase arrest， defective differentiation， and p53mediated apoptosis during organogenesis[J].Cell Cycle，2007，6（23）：2962-2969.

[17] 趙占克， 王玉鳳.組蛋白伴侶在發育過程中的功能[J].遺傳，2010，32（1）：41-48.

[18] 宋松泉，程紅焱，龍春林，等.種子生物學研究指南[M].北京：科學出版社，2005.

[19] VANDERAUWERA S， DE BLOCK M，VAN DE STEENE N，et al.Silencing of poly（ADPribose） polymerase in plants alters abiotic stress signal transduction[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2007，104（38）：15150-15155.

[20] 李曉陽，陳慧澤，韓榕.UV-B輻射對擬南芥種子萌發和幼苗生長的影響[J]. 植物學報，2013，48（1）：52-58.