RP-HPLC法測定載替加環素脂質微泡的包封率

任雅君，王海翔，王歲樓*，徐艷艷，田吉來

(1.中國藥科大學工學院，江蘇 南京 210009；2.麗水市中心醫院臨床藥學室，浙江 麗水 323000； 3.南京中醫藥大學醫學與生命科學學院，江蘇 南京 210023)

替加環素(Tigecycline)為甘氨酰環素類抗菌藥，半合成四環素米諾環素的衍生物。為第一個批準上市的甘氨環素類抗菌藥物。該藥克服了四環素的兩種主要耐藥機制：藥物特異性外排泵和核糖體保護。替加環素對許多革蘭陽性和陰性細菌有效，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素耐藥的腸球菌以及產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。其通過與核糖體30S亞單位結合、阻止氨酰化tRNA分子進入核糖體A位而抑制細菌蛋白質合成。因其不受β內酰胺酶、靶位修飾和酶靶位改變等耐藥機制的影響，具有廣譜抗菌活性[1]。但由于替加環素組織分布廣、蛋白結合率高、腦脊液濃度低、臨床常規治療多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDRAB)顱內感染療效差的問題，其臨床療效受到限制[2]。

超聲聯合微泡技術(ultrasound combining microbubbles，USCM)被證實可以有效、安全和可逆地打開血腦屏障，是一種理想的實現藥物靶向性、無創地進入顱內組織的技術方法[3-4]。其原理是將超聲微泡造影劑(ultrasound contrast agents,UCA)作為載體，將藥物包載于微泡中，后通過超聲輻照定點靶向釋放藥物達到治療的目的[5-6]。具體來說，即靜脈注入載藥微泡后，用超聲輻照特定部位，含氣體的超聲造影劑在超聲波的作用下會不斷地產生非對稱性收縮和膨脹，當聲能達到一定強度時，微泡就會破裂，這樣藥物就被釋放到超聲所輻照的局部組織中，從而發揮定位靶向治療作用。目前，測定替加環素含量多用反相液相色譜法：Li等[7-8]等均采用C18柱、磷酸緩沖液-乙腈(72∶25)作為流動相測定替加環素含量，出峰時間8 min左右，均獲得良好的線性及回收率；吉同琴等[9-10]采用C18柱、乙酸銨溶液(含EDTA和四氫呋喃以及三乙胺調pH 7.9)為流動相，出峰時間15 min左右，線性與回收率良好。

本試驗制備了不同藥脂比的載替加環素脂質微泡，通過查閱大量文獻，優化建立新型高效液相色譜(HPLC)法測定其包封率，以篩選出最佳藥脂比，同時證實了微泡與藥物聯用的可行性，為后期超聲輻照靶向釋放藥物試驗奠定了基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LCsolution 15C型高效液相色譜儀(日本島津公司)；AX224型分析天平(日本島津公司)；FD-1C-50型真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)；YJ-100型銀汞膠囊調合器(杭州新亞光電儀器有限公司)；恒溫磁力攪拌器(美國Scilogex公司)；TGL-16G型冷凍超速離心機(上海安亭科學儀器廠)；pH測定儀(上海雷磁儀器廠)。

1.2 試藥 二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC，蘇州東南藥業股份有限公司)；1,2-棕櫚酰磷脂酰甘油鈉(DPPG-Na，蘇州東南藥業股份有限公司)；生物素化磷脂(DSPE-PEG2000-Biotin，Aladdin公司)；替加環素標準品(99%，批號：291641，北京百靈威科技有限公司)；SF6(99.999%，南京上元工業氣體廠)；pH=7.4磷酸鹽緩沖液(PBS，自制)；甘油、叔丁醇、草酸、磷酸二氫鈉、EDTA-2Na、三乙胺均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 載藥微泡的制備

2.1.1 空白脂質微泡的制備 稱取一定量DSPC、DPPG-Na、DSPE-PEG2000-Biotin溶于20 mL叔丁醇，再加入適量PEG4000和少量棕櫚酸，60 ℃水浴溶解60 min；冷凍干燥30 h；取凍干粉一瓶加入1 mL PBS/甘油水合液45 ℃水化30 min，4 ℃靜置20 min，再水化30 min，室溫放置。磷脂濃度為4 mg·mL-1。充入SF6氣體，銀汞膠囊調和器振蕩90 s。空白脂質體制備完成，靜置分層，上層乳白色泡沫狀，下層清液。4 ℃保存。

2.1.2 載替加環素脂質微泡的制備 成膜材料及輔料同空白微泡，再分別精密稱取4、2和1 mg的替加環素，用適量叔丁醇溶解后，緩慢加入磷脂溶液中，60 ℃水浴攪拌1 h。其余步驟同“2.1.1”項下。即制得藥脂比分別為10∶1的T1組、20∶1的T2組和40∶1的T3組三組載藥微泡。載藥微泡靜置分層，上層呈黃綠色泡沫狀，下層清液。4 ℃保存。

2.2 色譜條件

2.2.1 色譜柱 Welch XB-C18柱(4.6 mm× 150 mm，3 μm);流速:1 mL·min-1;柱溫:25 ℃;進樣體積:20 μL。

2.2.2 流動相 磷酸鹽緩沖液[(0.015 mol·L-1的磷酸二氫鈉溶液和0.015 mol·L-1的草酸以及0.002 mol·L-1的EDTA-2Na(三乙胺調pH 7.0)]-乙腈溶液(75∶25)。使用前過0.45 μm有機濾膜。

2.2.3 檢測波長 在190～400 nm范圍內進行光譜掃描，得到替加環素的兩個較大吸收峰出現在248.1 nm和357.7 nm處，因在248 nm處的吸收更靈敏，響應值更大，故選擇248 nm作為最大吸收波長。

2.3 標準品溶液配置 精密稱取替加環素標準品5 mg超聲溶解于25 mL流動相中，制成0.2 mg·mL-1標準品儲備液。4 ℃保存。使用前過0.45 μm有機濾膜。取20 μL進樣測定，觀察保留時間、峰形與拖尾因子，結果如圖1。

圖1 替加環素標準溶液0.2 mg·mL-1色譜圖

3 方法學驗證

3.1 標準曲線繪制 取儲備液按照一定比例稀釋，配制成5、10、20、40、80、100、200 μg·mL-1一系列濃度標準品溶液，HPLC進樣測定，外標法定量。 以峰面積(UV)為縱坐標，濃度(μg·mL-1)為橫坐標做線性回歸。由結果可知，替加環素標準品200 μg·mL-1的色譜峰峰形良好，保留時間為7.728，理論塔板數為8 663.2，拖尾因子為1.2，無其他雜質峰。

標準曲線的線性回歸方程為Y=44 468X-121 566,R2=0.999 5。說明替加環素在5～200 μg·mL-1的濃度范圍內線性良好。

3.2 重復性測試 配6份40 μg·mL-1替加環素標準品溶液，分別進樣測定。計算RSD值，結果如表1。由結果可知，6份相同濃度的標準品進樣結果的RSD=2.2%，說明該法重復度較好。

表1 RP-HPLC法測定替加環素含量的重復度試驗

3.3 精密度測定 取40 μg·mL-1標準品溶液連續測定6次，計算RSD(%)，結果如表2。由結果可知，連續6次進樣結果的RSD為2.1%，說明該方法精密度較好。

表2 RP-HPLC法測定替加環素含量的精密度試驗

3.4 加標回收率測定 取9份0.2 mL空白脂質微泡溶液，分別加入0.08、0.1、0.12 mg替加環素標準品。流動相定容至1 mL，配置成80、100、120 μg·mL-13種濃度加標待測液，每種3個平行，HPLC測定峰面積，計算濃度、回收率及RSD(%)，結果如表3。

由試驗結果可以看出，高、中、低3個濃度水平組的加標回收率分別為104.3%(RSD=0.8%)、100.3%(RSD=1.5%)、99.6(RSD=0.4%)。說明在本試驗條件下替加環素的回收率良好，輔料(空白脂質微泡)對主藥(替加環素)的測定無影響。該方法測定替加環素的含量可行。

表3 加標回收率試驗結果

3.5 包封率測定 采用高速離心沉淀法：混勻包裹的新鮮載藥微泡溶液樣品 1 mL，12 000 rpm離心 10 min后取下清液，過0.45 μm濾膜后進樣，測定游離的替加環素含量。每種樣品測定3次。

包封率(%)=(投入的替加環素總量-游離的量)/投入的替加環素總量×100%

載藥量(%)=(投入的替加環素總量-游離的量)/磷脂用量×100%

由表4及圖2所示，T1組、T2組和T3組的包封率分別為54.3%±4.9%、86.8%±0.6%和71.3%±1.6%；載藥量分別為5.4%±0.5%、4.3%±0和1.8%±0。三者的包封率都較為理想，T2組即藥脂比為20∶1的載藥微泡的包封率最大，T1組即藥脂比為10∶1的載藥微泡的包封率最小。因此，最終選擇藥脂比為20∶1作為載藥微泡的制備條件。

表4 3組載藥微泡包封率與載藥量測定結果

4 討論

4.1 流動相的選擇 替加環素是四環素的結構類似物，擁有該類化合物相似的化學特性。同時為含氮堿性藥物，極性較大，可以與金屬離子形成金屬螯合物，并吸附在反相色譜柱中的硅烷醇基上而難以洗脫，從而導致色譜峰拖尾[11]。此外，硅膠中的微量金屬可以導致硅羥基的酸性增強，也會導致主峰拖尾[12]。

為了消除金屬離子的影響，提高流動相的洗脫性，本試驗考察了磷酸、草酸、三乙胺以及EDTA-2Na的加入對色譜峰值的影響，包括拖尾因子、保留時間以及理論塔板數。試驗證明，草酸的效果較磷酸更好，三乙胺和少量EDTA-2Na的加入能夠改善峰形、提高峰形的對稱性、降低拖尾因子。因此最終選擇了磷酸緩沖液(加入適量草酸與EDTA-2Na，并用三乙胺調節pH至7.0)-乙腈(75∶25)為流動相，此時的替加環素色譜峰峰形理想，定量準確。

A.空白樣品色譜圖；B.T1組色譜圖；C.T2組色譜圖；D.T3組色譜圖圖2 不同樣品色譜圖

4.2 溶劑的選擇 由于替加環素在水中溶解度較好，試驗考察了以水作溶劑和以流動相作溶劑的替加環素色譜峰，發現流動相作溶劑的色譜峰拖尾因子更小，理論塔板數更大，峰形更理想。原因可能是流動相具有更接近中性的pH，而替加環素在中性溶液中穩定性更好。因此采用現配現用的流動相作為溶劑和稀釋劑。

4.3 包封率測定方法的選擇 測定載藥微泡包封率的方法有很多種，如超速離心法、凝膠層析法、超濾膜過濾法、微型柱離心法和透析法等[13]。凝膠層析法、超濾膜過濾法、微型柱離心法均較煩瑣、耗時長、原材料較貴，對脂膜或藥物有一定吸附，導致檢測誤差增大，而且大小為微米級的微泡經分離柱洗脫時很難保證順利通過以及不被破壞，而透析法會因多次換液透析后，測算相對困難，因此，本試驗選擇了超速離心法作為載替加環素微泡包封率的檢測方法，此方法快速準確、操作簡便。通過離心將未包封進微泡的藥物濾出，測定其中藥物含量，再由投藥總量計算包封在微泡內的藥物含量。此為間接計算包封率的方法，結果顯示本試驗制備工藝下脂質微泡有較為理性的包封率。