LLE和HS-SPME與GC-MS聯用分析醬香型鹽菜味缺陷酒中揮發性物質

楊亮，陳雙，徐巖*

1(茅臺學院 釀酒工程系，貴州 仁懷，564501)2(江南大學 生物工程學院，釀造微生物與應用酶學實驗室，江蘇 無錫，214122)3(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

醬香型白酒是中國白酒工藝最為復雜和獨特的代表性產品，有關其酒體風味的研究也受到科研領域的關注，如酒體風味方法學研究、不同年份醬香型白酒主體風味物質、醬香型白酒特征性風味物質等[1-2]。

作為傳統釀造飲品的一種，醬香型白酒在釀造過程中不可避免地會產生一定量的缺陷酒，典型的8種缺陷風味為泥臭味、鹽菜味、異味、泥味、餿味、泥霉味、霉味和煤油味。現階段，針對醬香型缺陷酒的研究較少，且學術界與醬香型酒企對缺陷風味的描述有所區別[3]。如CHEN等[4]研究發現，醬香型白酒的爛卷心菜、焦橡膠等異嗅來源是甲硫醇、乙硫醇等揮發性硫化物；DING等[5]鑒定了導致多種白酒(含醬香型白酒)呈現出動物臭/皮毛臭的異嗅物質為4-甲基苯酚。對醬香型缺陷酒研究的不足，一方面是由于科研人員缺乏行業背景，對醬香型缺陷酒的風格把握不夠準確，以及科研院所和企業對接溝通的屏障，無形中給缺陷酒的研究帶來障礙；另一方面，缺陷風格有可能是由多種物質相互作用引起，化合物相互作用影響風味的表征，也給研究帶來了困難。

對于白酒風味物質的研究方法，通常在風味物質提取的基礎上，采用氣相色譜質譜聯用(gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS)等技術[6-7]對化合物進行定性或定量分析。其中的風味物質提取多采用液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)和頂空固相微萃取(head-space solid phase microextraction，HS-SPME)兩種方法[8-9]，而這兩種方法提取物各有側重點，提取結果有一定差異。

本文針對尚未報道的醬香型鹽菜味缺陷酒，采用LLE和HS-SPME兩種前處理方法，通過GC-MS分析結合保留指數法，分析鹽菜味缺陷酒的風味物質，為后續研究提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

固相微萃取頭(DVB /CAR/PDMS)，加拿大Supelco公司；氣相色譜(GC 6890N)/質譜(MS 5975)，美國Agilent公司；SPME自動進樣裝置，德國Gerstel公司；Milli-Q超純水系統，美國Millipore公司。

1.1.2 主要試劑

C5～C30烷烴標準品(色譜純)，天津光復精細化工研究所；無水乙醚、NaCl、Na2SO4(分析純)，上海國藥集團；戊烷(色譜純)，購自德國CNW公司。

1.1.3 實驗材料

酒樣(醬香型鹽菜味缺陷酒)，由貴州茅臺鎮某酒廠提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 LLE

參考WANG等[10]的方法，并作適當調整。50 mL酒樣用煮沸過的超純水稀釋至乙醇體積分數為12%，加NaCl直至飽和。50 mL重蒸的乙醚∶戊烷(1∶1)萃取3次。有機相記為萃取液1(Extract 1)。復合萃取液1將進一步分離成酸性、水溶性、中性3部分。

用150 mL超純水和40 g NaCl加入到Extract 1中，以10% NaHCO3溶液調pH至10，靜置分層，然后用分液漏斗分離后保存。分液漏斗底部分離出來的記為“水相1”，從分液漏斗上部取出的記為“Extract 2”。在分液漏斗中用10 mL超純水洗Extract 2，有機相收集記為“Extract 3”。混合剩余水相部分和“水相1”，混合水相在分液漏斗中用2 mol/L H2SO4調pH至2，再用25 mL重蒸乙醚萃取3次，乙醚萃取物添加10 g Na2SO4過夜干燥。萃取液氮吹濃縮至200 μL，濃縮液記為“酸性/水溶性組分”。“Extract 3”添加10 g Na2SO4過夜干燥后，氮吹濃縮至200 μL，記為“中性組分”。3種組分待GC-MS進一步分析。

1.2.2 HS-SPME

將1 mL酒樣、4 mL超純水及1.5 g NaCl加入頂空瓶內，迅速用帶特氟龍墊片的空心鐵蓋密封。密封后采用Gerstel MPS 2多功能自動進樣器對樣品進行頂空固相微萃取。萃取條件：2 cm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭，萃取溫度為40 ℃，樣品平衡5 min，吸附萃取40 min。萃取結束后萃取頭于GC進樣口250 ℃解析附5 min，進行GC-MS檢測分析。

1.2.3 GC-MS分析

GC條件：進樣口溫度為250 ℃，載氣為高純He，流速2 mL/min，進樣模式為不分流進樣。DB-FFAP(60 m×0.25 mm × 0.25 μm)升溫程序為40 ℃保持2 min，5 ℃/min升至230 ℃，保持20 min。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度 230 ℃，質量掃描范圍m/z35～500 amu。

1.2.4 定性分析

化合物經過質譜庫檢索與NIST 14(Agilent Technologies Inc.)標準質譜圖比對初步定性。在酒樣相同的GC-MS分析條件下，對C5～C30正構烷烴混標分析，根據正構烷烴中各烷烴的保留時間，根據改進的Kovats法[11]計算初步定性的各化合物的保留指數，并與文獻報道的保留指數對比鑒定。

2 結果與討論

本實驗采用LLE及HS-SPME兩種前處理方法，對醬香型鹽菜味缺陷酒中的揮發性物質做了定性研究，其中LLE萃取的物質又細分為酸性組分、堿性組分和中性組分，圖1中a-d依次為這3種組分及HS-SPME的GC-MS檢測總離子色譜圖。

a-酸性組分；b-堿性組分；c-中性組分；d-HS-SPME組分圖1 LLE萃取組分及HS-SPME萃取的GC-MS總離子色譜圖Fig.1 GC-MS total ions chromatogram of ingredients extracted by LLE and HS-SPME

從圖1可以明顯看出，LLE前處理的3種組分中，萃取物質種類含量依次為中性組分>酸性組分>堿性組分。但從離子圖較難辨別LLE檢測物質種類與HS-SPME的區別，需通過質譜庫及保留指數等方法進一步分析。

經質譜庫及保留指數鑒定，HS-SPME檢出56種化合物，LLE檢出58種化合物，2種前處理方法檢出物質中有38種重復，共檢出的76種物質如表1所示。LLE的3種組分中，酸性組分19種，堿性組分7種，中性組分42種，其中有9種物質在2種或3種組分中都有檢出，重復出現的物質主要為醇類、呋喃類及含氮化合物。

表1 LLE、SPME萃取醬香型鹽菜味缺陷酒揮發性物質GC-MS檢測結果Table 1 Compare GC-MS results of pickled mustard (Brassica juncea)like off-flavor liquor of maotai-flavor by LLE and SPME

續表1

序號名稱CasRI鑒定依據前處理方法SPMELLE香氣特征d39壬酸乙酯123-29-51507MS,RIL+果蜜味40dl-2-羥基己酸乙酯c6946-90-31510MS,RIL++-41甲酸辛酯112-32-31490MS+果味玫瑰42乳酸異戊酯19329-89-61642MS,RIL+果香奶油43丁二酸二乙酯c123-25-11711MS,RIL+熟蘋果44己酸己酯6378-65-01631MS,RIL+草本水果45癸酸乙酯c110-38-31601MS,RIL++蘋果46乙酸苯乙酯c103-45-71805MS,RIL++玫瑰水果47月桂酸乙酯c106-33-21864MS,RIL+肥皂48苯乙酸乙酯c101-97-31838MS,RIL++花香蜂蜜49丁酸苯乙酯103-52-61939MS,RIL+霉、果香50十四酸乙酯c124-06-12060MS,RIL++紫羅蘭51十五酸乙酯c41114-00-52159MS,RIL++蜜、甜5213-甲基-十四烷酸乙酯c100033-66-52105MS++-539-十五碳烯酸乙酯c56219-09-12148MS++-54軟脂酸乙酯c628-97-72245MS,RIL++乳脂香559-十六碳烯酸乙酯c54546-22-42254MS,RIL++-56油酸乙酯c111-62-62456MS,RIL++脂肪蠟味57反油酸乙酯c6114-18-72436MS,RIL++-酚類58愈創木酚(Guaiacol)ac90-05-11845MS,RIL+煙熏594-乙基苯酚c123-07-92160MS,RIL+酚、煙熏602,4-二叔丁基苯酚c96-76-42322MS,RIL++酚味內酯類61γ-丁內酯c96-48-01669MS,RIL+奶油62γ-壬內酯c104-61-02066MS,RIL+椰子,桃63(Z)-Oxacyclopentadec-6-en-2-onec63958-52-12034MS++-呋喃類64糠醛bc98-01-11440MS,RIL++甜、杏仁655-甲基呋喃醛ac620-02-01528MS,RIL+焦糖665-甲基-2-乙酰基呋喃c1193-79-91677MS,RIL+霉堅果67糠醇abc98-00-01648MS,RIL++霉、焦糖682,2-亞甲基雙呋喃1197-40-61627MS,RIL+烘烤含氮化合物692,3-二甲基吡嗪bc5910-89-41351MS,RIL++烤堅果702-乙基-6-甲基吡嗪c13925-03-61354MS,RIL+烤土豆712,3,5,6-四甲基吡嗪abc1124-11-41426MS,RIL++堅果、霉722-乙酰基吡咯c1072-83-91930MS,RIL+霉、果香含硫化合物73二甲基三硫c3658-80-81438MS,RIL++硫、洋蔥烴類及其他74(2,2-二乙氧基乙基)苯a6314-97-21714MS,RIL++花香752,5-二甲氧基甲苯24599-58-41812MS,RIL+-764-烯丙基-1,2-亞甲基二氧基苯94-59-71915MS,RIL+香醇、木

注：“+”：檢測出此物質；a：LLE酸性組分中檢出；b：LLE堿性組分中檢出；c：LLE中性組分中檢出；d:通過文獻查閱的化合物的香氣特征。

圖2 LLE、SPME萃取香氣物質種類數量比較Fig.2 Compare the variety of LLE,SPME extraction of aroma compounds

酯類化合物是2種前處理方式檢測出的種類最多的化合物，共31種，其次為酸類、醇類和醛酮類，依次有10種、9種和7種。檢測出的丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、苯乙醇等化合物以及硫化物二甲基三硫被認為是醬香型白酒風味物質中最有效的幾種香味物質[13]。

揮發性酚類化合物[14]和含硫化合物[15-16]多為底閾值化合物，對醬香型白酒風味有重要貢獻。酒體中的呋喃類化合物主要貢獻焦糖和烤焦的香[17-18]，內酯類多有椰子、奶油、桃香等風味[19]，而由糖和氨基酸殘基之間的美拉德反應或微生物代謝產生含氮化合物，如吡嗪等，主要貢獻烘烤香[20-21]。其中分別具有酚類氣味和烘烤氣味的風味物質2,4-二叔丁基苯酚和2,2-亞甲基雙呋喃在白酒中首次報道。檢出的76種化合物，未發現具有典型鹽菜味的物質，原因主要有以下兩點：一方面，儀器掃描靈敏度限制了化合物的全面挖掘，一些含量較低但閾值較高的化合物未被檢測出；另一方面，鹽菜味缺陷或許并非由單一物質引起，而是由多種化合物相互作用以表征出此風味。

綜上所述，結合使用LLE和HS-SPME兩種方法提取鹽菜味缺陷酒風味物質后，再通過GC-MS分析，并采用保留指數驗證，可更全面地檢測出鹽菜味缺陷酒的主體風味物質，而鹽菜味的特征異嗅物質的鑒定及風味物質間的相互作用關系，有待進一步深入研究。

3 結論

本研究采用GC-MS法首次分析了醬香型鹽菜味缺陷酒的風味物質，并采用LLE和HS-SPME兩種方法對酒樣進行前處理，彌補了2種前處理方法在鑒定物質方面的傾向性的不足，檢測的酒體風味物質的更加全面。對醬香型鹽菜味缺陷酒的風味物質的組成進行了分析，為進一步研究奠定了基礎。