皺紋盤鮑腹足抗氧化肽的制備及其工藝優化

顏琳，姜雙雙，閆欣，姚艷艷，常麗榮*，李長青

1(國家海產貝類工程技術研究中心，山東 榮成，264300)2(威海長青海洋科技股份有限公司，山東 榮成，264300)

皺紋盤鮑(Haliotisdiscushanai)主要出產于我國山東半島和遼東半島，是我國北方地區著名的海珍品主要養殖品種之一[1]。皺紋盤鮑在所有鮑品種中，雖然其個體為中等大小，但由于皺紋盤鮑腹足處的肌肉鮮嫩，肉質口感極佳，深受消費者歡迎。目前，我國的皺紋盤鮑主要產業利用方向集中在生鮮及食品熱加工等領域，主要產品加工形式相對單一，例如生鮮鮑、冷凍鮑、干鮑、煮制風味鮑、鮑罐頭，對于皺紋盤鮑肉質資源的精深加工領域的研究極少。研究表明，皺紋盤鮑的腹足含有豐富的蛋白質，其中，除含有少量膠原蛋白外，大部分為不易被人體消化吸收的大分子蛋白質[2-3]。因此，如何高效地開發利用皺紋盤鮑腹足的蛋白質資源成為當前亟待研究開發的熱點。

本研究以成熟的皺紋盤鮑腹足為原料，利用蛋白酶酶解技術及響應面法，設計優化酶解制備皺紋盤鮑抗氧化肽的最佳工藝，探索深加工途徑，為皺紋盤鮑腹足蛋白質資源的高效精深加工提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟的皺紋盤鮑腹足，威海長青海洋科技股份有限公司提供。

酪蛋白、福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，天津諾維信生物技術有限公司；NaOH標準滴定溶液(0.5 mol/L)、HCl標準滴定溶液(0.1 mol/L)，天津標準科技有限公司；DPPH標準品，華夏科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸(TCA)、FeCl3、水楊酸、無水乙醇、維生素C、HCl、KOH、酒石酸鉀鈉、甲醛(36%)、NaOH、硼酸、H2SO4、CuSO4、K2SO4，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；pH計，上海雷磁創益儀器儀表有限公司；UV2800SPC紫外可見分光光度計，蘇州江東精密儀器有限公司；電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；分析天平，上海梅特勒；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；索氏脂肪提取器，上海洪紀儀器設備廠；臺式離心機，上海力康醫療器械有限公司；磁力攪拌器，寧波市群安實驗儀器有限公司；消化儀、凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；程控箱式電爐，上海精宏實驗設備有限公司；電爐，龍口市先科儀器有限公司。

1.3 皺紋盤鮑腹足營養成分分析方法

總蛋白質含量的測定：半微量凱氏定氮法；脂肪測定：索氏抽提法；灰分：炭化灼燒法；水分：恒溫干燥法。

1.4 酶解上清液的制備

選擇菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶為水解酶，以酶解上清液的水解度和還原力為評價指標。從冰箱中取出皺紋盤鮑腹足，打漿處理后解凍混勻，稱取5 g原料加蒸餾水配制成500 mL溶液，并按上述4種酶制劑產品標注的最適條件充分酶解后，100 ℃加熱滅酶，直至冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，取離心后的酶解上清液備用[4-5]。

1.5 最佳用酶的篩選

1.5.1 多肽得率的測定[6]

1.5.2 水解度的測定

2)由液氮冷浸前后的掃描電鏡觀察可知，液氮對飽水煤樣的破壞程度遠高于干燥煤樣，水結冰體積膨脹作用導致煤樣出現裂隙延伸、裂隙加寬等現象，使煤體滲透能力大幅度提高。

(1)酶解液中總氮含量的測定：GB 5009.5。

(2)酶解液中氨基酸態氮含量的測定：GB 5009.235。

(3)水解度按公式(1)計算：

(1)

1.5.3 還原力的測定[7]

取酶解上清液1.0 mL于洗凈干燥的離心管中，加入pH 6.6，1.0 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，然后加入1.0 mL的1%(體積分數)鐵氰化鉀溶液，搖勻后將離心管置于50 ℃的恒溫水浴鍋中加熱2 min，將K3Fe(CN)6還原為K4Fe(CN)6·3H2O。結束加熱之后，取出離心管立即制冷放涼，加入1.0 mL的10%(體積分數)TCA溶液，充分反應之后，于4 000 r/min條件下離心5 min。取上清液2.0 mL，依次加入2.0 mL蒸餾水與0.8 mL的0.1%(體積分數)的FeCl3溶液，混合均勻，靜置10 min之后，于700 nm波長處測定吸光值，其值即可表征產物的還原能力。Vc代替樣品作為陽性對照，所有反應條件同上。并用蒸餾水作為空白調零。

1.5.4 DPPH·清除率的測定[7-8]

準確稱取一定量DPPH·標準品，用氯仿配制成2 mol/L溶液，然后用無水乙醇將其稀釋成0.1 mmol/L的DPPH·儲備溶液。分別按不同濃度吸取0.4 mL各酶解上清液，再加入0.4 mL的DPPH·儲備溶液，充分混勻后作為樣品組A；吸取不同濃度范圍的酶解上清液0.4 mL，再加入0.4 mL無水乙醇，充分混勻后作為對照組A1；吸取0.4 mL的蒸餾水，加入0.4 mL的DPPH·，混勻后作為空白組A0，然后在室溫條件下避光反應，放置30 min，將反應后的溶液置于離心機中，在8 000 r/min條件下離心10 min。取離心后的上清液在517 nm波長處測定吸光值。同時用Vc作為該實驗的陽性對照,如公式(2)所示：

(2)

1.6 酶解工藝的優化

根據單因素預實驗選擇主要因素為酶解時間、酶解溫度、pH，以DPPH·清除率為響應值，分別對每個影響因素選取3個水平。按照曲面響應相應的實驗組合設計表進行實驗，對所有實驗數據進行二次回歸擬合，得到多元二次回歸方程，并分析各因素產生的主效應和交互效應，在一定的水平范圍內求最佳值[9-11]。Box-Benhnken實驗設計因素水平表見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 皺紋盤鮑腹足營養成分分析

皺紋盤鮑腹足的基礎營養成分見表2。

表2 皺紋盤鮑腹足營養成分 單位：%Table 2 Nutritional composition of abdomen of Haliotis discus

李蘋蘋[12]曾測定幾種貝類的蛋白質含量：櫛孔扇貝12.30%、文蛤10.70%、太平洋牡蠣9.83%和毛蚶8.20%；另外，據相關文獻論證雜色鮑、綠鮑、皺紋盤鮑腹足的蛋白質含量分別為20.36%、21.63%、16.87%左右[13-14]。由表2可知，本實驗中皺紋盤鮑腹足的蛋白含量測定結果為18.77%，相比之下，蛋白質含量高于上述其他貝類，且與上述研究中的其他品種鮑魚的蛋白質含量大致相同。由此可見，皺紋盤鮑屬于高蛋白類貝類，是制備抗氧化肽酶解液的理想原料。

2.2 最佳蛋白酶的篩選

不同蛋白酶對鮑腹足的作用位點和作用環境不同，所獲得的多肽肽鏈長短及性質不同[15]，酶解相同的原料，會產生不同的短肽，因此對于酶解同一種原料而言，最優蛋白酶的篩選成為本實驗的關鍵點。

2.2.1 不同蛋白酶對水解度的影響

水解度即蛋白質被水解的肽鍵數占蛋白質水解的總肽鍵數的百分數[16]。由圖1可知，中性蛋白酶和堿性蛋白酶在前3 h迅速酶解蛋白質，水解度迅速升高。木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶在1 h內迅速酶解蛋白質，在1～2 h酶解速度放緩，2～3 h酶解蛋白質速度又迅速升高，水解度也隨之迅速升高。在酶解6 h之后，4種蛋白酶酶解液的水解度逐漸趨于穩定，說明對皺紋盤鮑腹足蛋白質的酶解反應基本完成，此時，中性蛋白酶的水解度最高，達到20.11%，堿性蛋白酶水解度最低，為15.96%，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解度分別為18.91%、16.95%。

圖1 不同蛋白酶對水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on degree of hydrolysis

2.2.2 不同蛋白酶對多肽得率的影響

多肽得率是不同蛋白酶對皺紋盤鮑腹足蛋白質的酶解程度的象征性指標，同時也是反映抗氧化肽酶解液中多肽含量的重要指標之一[10,17]。酶解1 h內，4種蛋白酶的多肽得率迅速增加，1 h后仍在逐漸增加直至趨于穩定。文獻顯示，蛋白酶酶解產生的多肽會被進一步分解成氨基酸[6]，酶解5 h后，菠蘿蛋白酶的多肽得率降低可能是上述原因所致。6 h后，中性蛋白酶的多肽得率持續升高，至8 h時，多肽得率達到最高，為72.16%，堿性蛋白酶的多肽得率最低，僅為55.93%(圖2)。

圖2 不同蛋白酶對多肽得率的影響Fig.2 Effect of different proteases on polypeptide yield

2.2.3 不同蛋白酶對還原力的影響

從圖3可以看出，隨著酶解時間的延長，還原力均不斷提高，說明部分氨基酸和抗氧化肽的抗氧化活性較強[18]。酶解前4 h，隨酶解時間延長，酶解產物的還原力逐漸提高，木瓜蛋白酶的酶解產物還原力在酶解1 h后提升速率變緩：酶解4 h后，中性蛋白酶和堿性蛋白酶的升高速率均呈現先升高后降低的趨勢，中性蛋白酶酶解液在酶解7 h還原力達到最高，為0.589；堿性蛋白酶酶解液在酶解第6 h還原力達到最高，為0.578。由此可見，中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解液的還原力相差不大，但是堿性蛋白酶需要較高的酶解pH條件，考慮到工業成本選用中性蛋白酶(圖3)。

圖3 不同蛋白酶對還原力的影響Fig.3 Effect of different proteases on reducing capacity

2.2.4 不同抗氧化肽酶解液對DPPH·的清除作用

DPPH·清除率是研究蛋白酶水解產物的體外抗氧化活性的一項重要指標[19]。如圖4所示，4種抗氧化肽酶解液對DPPH·清除作用各不相同，但對DPPH·的清除作用均很強，清除率一直保持在50%以上。中性蛋白酶酶解液的DPPH·清除率保持最高，5 h時達到最高，為95.63%；菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶均在酶解3 h時達到最高，分別為83.97%和89.63%；堿性蛋白酶在6 h時達到最高，為83.36%。

圖4 不同抗氧化肽酶解液對DPPH·的清除作用Fig.4 Clearance of DPPH· by different antioxidant peptidyl hydrolysate

綜合以上分析，中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解產生的抗氧化肽酶解液具有較高的水解度，中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產生的抗氧化肽酶解液具有較高的還原力，但中性蛋白酶酶解液對DPPH·的清除作用明顯優于另外3種。考慮成本，選擇中性蛋白酶。

2.3 響應面工藝優化

2.3.1 響應面實驗設計及結果

綜合預實驗中單因素所得結果，以DPPH·清除率為響應值，選取3個影響最大的因素：酶解時間、酶解溫度、pH，優化中性蛋白酶酶解皺紋盤鮑腹足的工藝。Box-Behnken組合實驗設計及結果見表3。

表3 Box-Behnken實驗設計及結果Table 3 Results of response surface experiments

運用Design Expert軟件，對以上17個實驗點響應值進行二次回歸分析，經回歸擬合后，得到以下多元回歸方程：

Y=93.83+0.45A+0.13B+3.39C-0.93AB+0.82AC+2.11BC-4.20A2-3.36B2-2.19C2

2.3.2 回歸模型的建立及分析

如表4回歸模型的各項方差分析結果所示，F檢驗可以反映回歸方程的有效性，失擬檢驗反映所用模型與實驗擬合的程度即二者差異的程度，校正決定系數R2用來評價回歸方程的優劣，變異系數反映數據離散程度的絕對值[20]。

表4 回歸模型顯著性分析Table 4 Analysis of significance with regression model

注：校正決定系數R2=0.957 0；*,在P<0.05水平上顯著。

本實驗設計中，模型F值為17.31，P值<0.05，表明該二次方程模型顯著；失擬檢驗P值>0.05，對模型是有利的，因此可以用該回歸方程代替真實實驗點對實驗結果進行分析。并且，復相關系數R2=0.957 0，這說明該模型的擬合性較好。綜合對上述各參數的分析，表明該實驗方法可靠，各因素水平的區間設計合理，可以用來對皺紋盤鮑腹足抗氧化肽的制備工藝進行初步分析和預測。

2.3.3 響應面優化分析

圖5、圖6和圖7為回歸方程得出的AB、AC、BC之間交互作用的響應面圖。

圖5 酶解時間與pH對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of the effect of enzymatic hydrolysis time and pH on DPPH· clearance

圖6 酶解溫度與pH對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the effects of enzymatic hydrolysis temperature and pH on DPPH· clearance

圖7 酶解時間和酶解溫度對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagram of the effects of enzymatic hydrolysis time and hydrolysis temperature on DPPH· clearance

通過對回歸方程的求導計算極大值，得到了對應的各主要因素分別為pH 7.10、酶解溫度50.25 ℃、酶解時間4.65 h。此條件下，抗氧化肽酶解液的DPPH·清除率的理論最高值為96.24%。

2.3.4 最優酶解工藝條件的驗證

采用上述優化后得到的酶解工藝條件：pH 7.10、酶解溫度50.25℃、酶解時間4.65 h，進行3次重復實驗，得到DPPH·清除率分別為：96.07%、95.88%、96.41%，多肽含量分別為：81.17%、79.93%、80.59%，平均多肽含量為80.56%，平均DPPH·清除率為96.12%，與預測理論值相比，其相對誤差僅為0.12%，這說明通過響應面設計實驗優化后得出的該回歸方程對本實驗具有重要的實踐指導意義。

3 結論

皺紋盤鮑腹足蛋白質含量高達18.77%，是一種很好的蛋白質利用資源。優化得到皺紋盤鮑腹足抗氧化肽的酶解工藝為：pH 7.10、酶解溫度50.25 ℃、酶解時間4.65 h。驗證顯示，實際值與預測理論值的相對誤差僅為0.12%，且平均多肽含量可達到80.56%，說明在該工藝條件下制備出的抗氧化肽酶解液效果較好。本文所研究制備的皺紋盤鮑腹足抗氧化肽是以純天然的皺紋盤鮑腹足為原材料提取，與傳統人工合成的抗氧化劑相比較，其抗氧化性能更加穩定、更加綠色環保，更容易被消費者接受。同時，該研究也可為食品添加劑和化妝品產業帶來巨大的商業潛力，為促進皺紋盤鮑腹足的精深加工和開發提供有力的支持。