泡菜中降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及生物學特性研究

郭志華，張興桃，段騰飛，錢佳佳，葉靜，張夢婷

(宿州學院 生物與食品工程學院，安徽 宿州，234000)

泡菜是以新鮮蔬菜為原料，在乳酸菌和酵母菌等菌群的作用下通過厭氧發酵而生成的一種發酵食品[1]。乳酸菌指發酵糖產生乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱，被稱為“公認安全菌株”(generally regarded as safe,GRAS)[2]。泡菜在腌制過程中不可避免地產生亞硝酸鹽，過量的亞硝酸鹽能夠與胃內食物中的仲胺類物質相互作用，轉化為亞硝胺，而亞硝胺具有強烈的致癌作用[3]。人體長期攝入亞硝酸鹽可導致胃癌[4]、肺癌[5]、甲狀腺癌[6]等癌癥。此外，亞硝酸鹽還可使血紅蛋白氧化成高鐵蛋白，失去攜氧能力，造成低氧血癥，嚴重時會危害生命[7]。許多研究表明乳酸菌在泡菜發酵過程中具有很好的降低亞硝酸鹽作用[8-9]，這是由于乳酸菌產生的亞硝酸還原酶和代謝產物乳酸，可降解和清除亞硝酸鹽[10]。丁娟芳等從揚州醬菜中篩選到一株乳酸腸球菌，培養24 h后亞硝酸鹽降解率達到91.7%[11]。杜曉華等從四川泡菜中篩選的植物乳桿菌，培養24 h后亞硝酸鹽降解率達到99.1%[12]。湯偉等從中國傳統發酵泡菜中分離的消化乳桿菌w369培養72 h后，對亞硝酸鈉的降解率為92.92%[13]。

人體攝入一定量的乳酸菌可以促進有益微生物的生長，抑制有害微生物的生長，保持腸道菌群平衡，減少腸道疾病的發生[14]。泡菜中的乳酸菌要在人體中發揮良好的保健作用，必須有足夠數量活性菌經過胃到達小腸，這就要求乳酸菌對胃腸道中的酸、膽鹽有較強的耐受能力，對體內環境有較強的適應性。隨著對乳酸菌的研究深入，發現乳酸菌也存在潛在的危害，泡菜中的乳酸菌有很多是野生的，乳酸菌有可能攜帶耐藥基因[15]。作為食品發酵菌株，有必要對發酵乳酸菌進行耐藥性檢測。

本研究主要是從泡菜中篩選降解亞硝酸鹽的乳酸菌進行菌株鑒定。研究乳酸菌產酸能力、降低亞硝酸鹽能力、耐酸性、耐膽鹽、抑菌性和耐藥性等生物學特性，為生產優質安全泡菜提供優良發酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗室自制泡菜、市售泡菜、民間收集泡菜。

MRS肉湯培養基，青島海博公司；細菌DNA提取試劑盒，Takara公司；16S上下游引物，上海生工；藥敏試紙，杭州天和公司；其余均為國產分析純或化學純。

大腸桿菌(Escherichiacoli)CICC 10907、腸沙門氏菌(Salmonellaenteric)CICC 10871、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 10790和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginos)CICC 21636，中國微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設備

722型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；AL204分析天平，上海精密儀表儀器有限公司；BBS-SDC-A超凈工作臺，吉林長春博科；MyCycler PCR擴增儀，美國Bio-Rad；SHP-250 型生化培養箱，江南生物儀器。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

用接種環蘸取少許泡菜底部汁液，在含有CaCO3的MRS培養基平板上劃線，37 ℃培養48 h，挑取有明顯溶鈣圈的白色單菌落接入MRS液體培養基,37 ℃培養48 h，進行革蘭氏染色鏡檢和接觸酶實驗，革蘭氏染色陽性、接觸酶反應陰性菌株初步鑒定為乳酸菌進行下一步實驗[10]。

1.3.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

將初步鑒定為乳酸菌的菌株接種于MRS液體培養基，37 ℃培養18 h，取新鮮菌液按10%(體積分數)接種于10 mL含有質量濃度125 mg/L NaNO2的MRS液體培養基，37 ℃培養48 h，加入2 mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5 min，再加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，避光靜置15 min，觀察各菌株培養液的顏色變化，選出顏色較淺的菌株，進行復篩[12]。

初篩菌株活化后，按5%(體積分數)接種于含有125 mg/L NaNO2的MRS液體培養基中，37 ℃培養48 h，測定培養前后培養液中NaNO2含量，計算公式如式(1)所示，計算亞硝酸鹽降解率，選取亞硝酸鹽降解力較強的菌株[11]。

(1)

亞硝酸鹽含量的測定采用GB/T 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸萘乙二胺分光光度法[16]。

1.3.3 乳酸菌的鑒定

1.3.3.1 乳酸菌形態特征觀察

觀察單菌落顏色、形狀、邊緣、表面等培養特征；革蘭氏染色鏡檢菌體顏色、形狀、排列方式等形態特點。

1.3.3.2 16S rDNA的擴增和序列分析

采用Takara細菌基因組DNA提取試劑盒提取乳酸菌基因組，以細菌16 S rDNA通用引物27f為上游引物，1492r為下游引物，基因組DNA為模板擴增16 S rDNA片段。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min，32 個循環(95 ℃變性1 min；55 ℃退火90 s；72 ℃延伸2 min)，72 ℃延伸10 min。PCR產物由上海生物工程有限公司測序，所得16 S rDNA序列提交NCBI網站進行BLAST核酸數據比對[13]。

1.3.4 乳酸菌生物學特性研究

1.3.4.1 乳酸菌發酵產酸能力測定

設置3個試驗組，分別為乳酸菌JYF2接種發酵(JYF2組)，乳酸菌JYF3接種發酵(JYF3組)和自然發酵(ZR組)，含有5%食鹽和3%白糖的溶液，121 ℃，5 min滅菌后備用。乳酸菌JYF2和JYF3，37 ℃培養48 h，按10%(體積分數)接入5%食鹽和3%白糖的溶液，制得乳酸菌接種發酵泡菜汁，ZR組泡菜汁不添加任何菌。新鮮白菜洗凈除去老葉，取薄厚均勻的菜葉切成約10 cm×4 cm的長條，取200 g置于500 mL廣口瓶中，加入400 mL乳酸菌發酵泡菜汁和無菌泡菜汁，蓋上瓶塞密封，28 ℃發酵[17]。

每天取發酵液混勻后，用pH計測pH值?？偹岬臏y定按GB/T12456—2008《食品中總酸的測定》[18]進行，總酸含量以乳酸計。

1.3.4.2 發酵中亞硝酸鹽含量測定

按照1.3.4.1發酵3組泡菜，每天取白菜葉按照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定發酵白菜的亞硝酸鹽含量[16]。

1.3.4.3 乳酸菌耐酸性測定

菌株活化后離心，棄上清液，菌體中分別加入pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的無菌生理鹽水，混勻后37 ℃保溫3 h，分別再加入無菌生理鹽水后0 h和3 h取培養物，稀釋涂布MRS平板，37 ℃培養48 h后計數，按公式(2)計算存活率。

(2)

式中：N1和N2分別為菌株接入不同pH值的無菌生理鹽水培養3 h和 0 h后的活菌數。

1.3.4.4 乳酸菌耐膽鹽性測定

菌株活化后分別按5%接種于含0.01、0.02、0.03、0.04和0.05 g/L豬膽鹽的MRS液體培養基中，37 ℃培養18 h，稀釋涂布MRS平板，37 ℃培養48 h后計數，按公式(2)計算存活率。

(3)

式中：P1和P2分別為菌株接入不同濃度膽鹽培養后的活菌數和不含膽鹽培養后的活菌數。

1.3.4.5 乳酸菌株對常見致病菌的抑菌性研究

采用牛津杯法測定乳酸菌的抑菌性能，取大腸桿菌CICC 10907，腸沙門氏菌CICC 10871，金黃色葡萄球菌CICC 10790和銅綠假單胞菌CICC 21636新鮮菌液培養至菌液濃度為105～106CFU/mL，并均勻涂布在牛肉膏蛋白胨培養基上，然后將牛津杯放在平板上，將乳酸菌菌液置于牛津杯孔中，37 ℃培養24 h，觀察抑菌結果。

1.3.4.6 乳酸菌耐藥性研究

采用細菌藥敏紙片瓊脂擴散法，將乳酸菌菌液培養至105～106CFU/mL，然后均勻涂布在MRS瓊脂平板上，將滅菌水紙片、青霉素G紙片、氨芐青霉素紙片、慶大霉素紙片、鏈霉素紙片、氟哌酸紙片、氯霉素紙片和紅霉素紙片貼于MRS瓊脂平板上，37 ℃培養48 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

所有實驗均進行3次平行，實驗數據采用Origin 8.5進行統計分析，各組數據之間進行單因素方差分析，P<0.05表示數據間存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

蘸取少許泡菜汁在含CaCO3的MRS固體培養基上劃線，有34株菌有明顯的溶鈣圈，其中有26株菌革蘭氏染色陽性，接觸酶反應陰性，初步鑒定為乳酸菌，編號為S-1、S-2等。

將分離純化的26株乳酸菌，按5%接種量接入含有125 mg/L NaNO2的MRS液體培養基中，37 ℃培養48 h，鹽酸萘乙二胺的顯色結果,如圖1所示。

圖1 部分乳酸菌鹽酸萘乙二胺顯色反應結果Fig.1 Result of N-naphthylethylenediamine dihydrochloride reaction of partial lactic acid bacteria注：從左到右試管編號：S-2、S-13、S-4、S-8、S-12、S-9、S-14、S-18、S-11、S-5。

不同乳酸菌產生不同程度的顯色，顯色機理是NaNO2在酸性環境下與對氨基苯磺酸生成重氮鹽，重氮鹽再與鹽酸萘乙二胺進行偶合反應生成紫紅色的偶氮化合物[13]。顏色越深,NaNO2含量越高，顏色越淺,NaNO2含量越低。MRS液體培養基中的NaNO2經乳酸菌降解，降解能力越強，NaNO2含量越低，顏色越淺。由圖可見，不同乳酸菌均具有一定降解能力，但是降解NaNO2能力不同。所以，選取其中顯示淺粉紅色的6株菌進行復篩，重新命名為JYF1、JYF2、JYF3、JYF4、JYF5、JYF6。

初篩6株菌按5%接種量接種到含NaNO2的MRS液體培養基中，37 ℃培養48 h，每隔12 h測NaNO2降解率。如表1所示，6株乳酸菌的降解亞硝酸鹽能力較強。在12 h時6株菌NaNO2降解率低于33%，可能是前12 h乳酸菌生長處于延滯期，細菌活動不旺盛，菌體數量較少，對亞硝酸鹽的降解率較低[19]。從12 h開始，各菌株對亞硝酸鹽的降解率逐漸加快，24 h有5株乳酸菌的降解率大于65%，36 h有5株菌的降解率大于90%，對亞硝酸鹽的降解基本上已達到最高峰，可能是這段時間乳酸菌的生長處于對數期，細胞生長旺盛，菌體數量增多，分泌亞硝酸鹽還原酶增多，同時乳酸菌產生較多乳酸，pH降低，促進亞硝酸鹽的分解[19-20]。

表1 乳酸菌48 h內NaNO2的降解率 單位：%Table 1 The degradation percentage of NaNO2 by lactic acid bacteria strains in 48 h

2.2 乳酸菌的鑒定

所篩6株菌在MRS固體培養基上菌落較小，圓形，凸起，表面光滑，邊緣整齊，不透明，革蘭氏染色后鏡檢陽性菌，短桿狀，無芽孢，成對或短鏈狀。

以6株乳酸菌的DNA為模板，PCR擴增得到約1.5 kb的序列片段，將各菌株的16S rDNA序列在NCBI中進行BLAST比對分析，結果發現JYF1、JYF2、JYF5和JYF6與植物乳桿菌的同源性分別為97%、98%、98%和98%；JYF3和JYF4與發酵乳桿菌的同源性為99%和98%。

根據培養特征、菌體特征和16S rDNA同源比對分析，JYF1、JYF2、JYF5和JYF6初步鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；JYF3和JYF4初步鑒定為發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)[21]。

結合NaNO2降解率，選取JYF2和JYF3為實驗對象，進一步研究其生物學特性。

2.3 乳酸菌生物學特性研究

2.3.1 乳酸菌發酵產酸能力測定

泡菜發酵是乳酸菌的選擇培養過程，乳酸菌在厭氧環境下利用糖類等底物，產生乳酸，提高總酸含量。由圖2可知，前4 d pH值和總酸含量變化幅度較大，因為發酵前4 d，乳酸菌數量不斷增加，產酸量不斷增大。接種JYF2的泡菜在發酵第4天，pH值是3，達到最低值，總酸含量達到15%；接種JYF3的泡菜在發酵第5天,pH值最小是3，總酸含量在接種第7天達到最大值是15%，組間組內顯著差異(P<0.05)。從第5天開始，發酵進入相對平穩期，pH值和總酸含量變化幅度較小。接種JYF2和JYF3泡菜的pH值比自然發酵的低，總酸量比自然發酵的高，可能是接種JYF2和JYF3的泡菜在發酵初期，在封閉的泡菜汁環境中，乳酸菌含量比自然發酵的高，促使乳酸菌優勢菌群的提前形成，加快泡菜的pH值降低、總酸含量增加。

圖2 泡菜發酵過程中pH值和酸度的變化Fig.2 Changes in pH value and titratable acidity during fermentation

2.3.2 乳酸菌降低亞硝酸鹽能力的測定

由圖3可知，3組泡菜均出現一個“亞硝峰”，接種乳酸菌的實驗組的“亞硝峰”均出現第3天，亞硝酸鹽含量峰值分別為17.5和18.8 mg/kg，低于國家標準限度值20 mg/kg[22]，2組亞硝酸鹽含量差異不顯著(P>0.05)。自然發酵泡菜的亞硝峰出現在第4天，亞硝酸鹽含量峰值為30.4 mg/kg，超過國家標準[22]。3組泡菜亞硝酸鹽含量在“亞硝峰”后，亞硝酸鹽含量均出現下降，接種組亞硝酸含量明顯低于自然發酵組，呈顯著水平(P<0.05)。發酵至第8天，接種組亞硝酸鹽含量分別為1.8和2 mg/kg，遠低于自然發酵組6.3 mg/kg。國家標準中規定，醬腌菜制品中亞硝酸含量不得超過20 mg/kg，盡管自然發酵泡菜的含量低于國家標準，但JYF2和JYF3的接入進一步降低了泡菜中的亞硝酸鹽，提高泡菜的食用安全性。

圖3 泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Changes in nitrite content of pickled during fermentation

2.3.3 乳酸菌耐酸性測定

人體胃酸pH值為1.5～4.5，食物在胃中停留時間約為2～3 h[23]。如圖4所示，當pH值為2時，2株菌存活率介于30%和50%之間，組間差異不顯著(P>0.05)；pH值為3時，2株菌的存活率大于60%，JYF2的存活率大于JYF3，且組間差異顯著(P<0.05)；pH值為4時，2菌株存活率均大于80%，組間差異不顯著(P<0.05)。由此可知，2株菌在人體胃液環境下有一定存活性。

圖4 乳酸菌在不同pH值下的存活率Fig.4 The survival rate of lactic acid bacteria under different pH condition

2.3.4 乳酸菌耐膽鹽性測定

乳酸菌進入人體消化道后，除了需要經受胃酸的考驗外，還需要經受人體小腸膽鹽環境的考驗，在胃腸道保持一定數量的活菌數，乳酸菌才能發揮其益生作用。如圖5所示，JYF2和JYF3兩株乳酸菌在膽鹽質量濃度為0.01和0.02 g/L時，存活率較高，在70%以上；膽鹽質量濃度在0.03 g/L時，2株乳酸菌存活率下降到46%和48%，接近50%；膽鹽質量濃度在0.04和0.05 g/L時，2株乳酸菌的存活率較低，小于30%。人體小腸中膽鹽質量濃度一般在0.003～0.03 g/L[24]，JYF2和JYF3在膽鹽質量濃度小于0.03 g/L時，存活率在50%以上，說明這2株菌對膽鹽有較好的耐受性。這2株菌在不同膽鹽濃度下的存活率，組間差異不顯著(P>0.05)，說明2株菌對膽鹽耐受性相近。

圖5 乳酸菌在不同膽鹽濃度下的生長Fig.5 Growth of lactic acid bacteria under different bile salt concentration

2.3.5 乳酸菌株對常見致病菌的抑菌性研究

由圖6可知，JYF2和JYF3的發酵菌液對4株致病菌均能產生抑菌圈，說明這2株菌對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌性。由圖6可知，2株菌對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于20 mm，組間差異不顯著(P>0.05)，這2株菌對革蘭氏陽性菌的抑菌效果相近。對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑小于20 mm，組間差異顯著(P<0.05)，說明2株菌對革蘭氏陰性菌的抑菌性有一定差異，且JYF2>JYF3。

圖6 乳酸菌抑菌實驗結果Fig.6 Antimicrobial activity test of lactic acid bacteria

2.3.6 乳酸菌耐藥性研究

選取7種較常見的抗生素檢測泡菜中分離的乳酸菌的耐藥性。由圖7可知，JYF2和JYF3對青霉素G、氨芐青霉素和紅霉素較敏感，抑菌圈直徑大于25 mm，組間差異不顯著(P>0.05)，說明這2株菌對青霉素G、氨芐青霉素和紅霉素敏感性相近。JYF2和JYF3對慶大霉素、鏈霉素、氟哌酸和氯霉素中等敏感，其中對氯霉素的敏感性差異顯著(P<0.05),說明這2株菌對氯霉素的敏感性存在一定的差異性。

圖7 分離乳酸菌的藥敏試驗結果Fig.7 The result of antibiotic sensitivity tests for isolated lactic acid bacteria

3 結論與討論

泡菜是新鮮蔬菜經微生物發酵而成的，不僅具有蔬菜的營養，而且含有大量活性乳酸菌。然而在蔬菜發酵過程中會產生亞硝酸鹽，亞硝酸鹽對人體健康有嚴重危害性。乳酸菌不僅是泡菜發酵劑，而且可以降解亞硝酸鹽，降低對人體健康的危害。本研究從傳統泡菜中初篩、復篩出降解亞硝酸鹽的6株乳酸菌，根據菌落特征、菌體特征和16S rDNA同源比對分析，4株鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；2株初步鑒定為發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。

泡菜發酵初期，泡菜汁中的氧使雜菌迅速生長繁殖，產生的硝酸還原酶將蔬菜中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，致使亞硝酸鹽含量增加[25]，經亞硝酸鹽誘導，乳酸菌能產生亞硝酸鹽還原酶，降低亞硝酸鹽。隨著氧的消耗，乳酸菌逐漸成為優勢菌，產生有機酸，抑制不耐酸雜菌的生長，同時pH降低，pH值<4.5時，亞硝酸鹽的降解主要以酸降解為主[12]。開發優良泡菜發酵乳酸菌首先要考慮乳酸菌的產酸性，分離篩選的JYF2和JYF3用在泡菜發酵中，比自然發酵的泡菜產酸量高，pH值低。接種乳酸菌泡菜的“亞硝峰”比自然發酵泡菜的“亞硝峰”提前1 d出現，亞硝酸鹽含量峰值分別為17.5和18.8 mg/kg，低于國家標準限度值20 mg/kg；自然發酵泡菜的“亞硝峰”亞硝酸鹽含量為30.4 mg/kg，超過國家標準。發酵至第8天，接種組亞硝酸鹽含量分別為1.8和2 mg/kg，遠低于自然發酵組6.3 mg/kg，JYF2和JYF3的接入降低了泡菜中的亞硝酸鹽含量，提高泡菜的食用安全性。

乳酸菌可抑制一些病原微生物的生長，調節人體胃腸道菌群平衡。JYF2和JYF3對一些常見病原微生物大腸桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌性，其中對革蘭氏陽性菌的抑菌性大于革蘭氏陰性菌。泡菜中的乳酸菌要發揮保健作用，必須要到達小腸，優良的乳酸菌對人體胃腸道環境要有耐受性。JYF2和JYF3當pH值為2時，2株菌存活率大于30%；pH值為3時，2株菌的存活率大于60%；pH值為4時，2株菌存活率均大于80%，2株菌在體外胃液環境下有一定存活性；JYF2和JYF3在膽鹽濃度小于0.3%時，存活率在50%以上，說明這2株菌對膽鹽有較好的耐受性。

許多傳統泡菜由蔬菜表面附著的乳酸菌發酵而成，由于濫用抗生素，環境中抗生素污染日益嚴重，蔬菜在種植過程中易受到澆灌水、土壤等環境抗生素的污染，導致蔬菜表面微生物易產生耐藥性[26]。泡菜食用時，一般不經過特殊加熱處理，耐藥乳酸菌會經過食物鏈進入人體，對人體健康造成潛在危害。選取7種較常見的抗生素檢測JYF2和JYF3的耐藥性，JYF2和JYF3對不同抗生素敏感性不同。

本研究從泡菜中篩選出6株降解亞硝酸鹽的乳酸菌，研究其中2株乳酸菌的益生特性，為生產低亞硝酸鹽泡菜提供優良乳酸菌，為開發乳酸菌功能性食品奠定基礎。