泡豇豆發酵過程中有機酸變化及對亞硝酸鹽降解的影響

徐柯，成林林，袁美，喬聰聰，曾凡坤,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

豇豆(Vignasinensis)又被稱為豆角，因其含有豐富的營養成分：葉綠素(160 mg/kg)、VC(190 mg/kg)、有機酸(0.2%)、蛋白質(1.5%)、可溶性固形物(10.15%)，被稱作“蔬菜中的肉類”[1]。但由于豇豆呼吸強度大于普通蔬菜，采收后如果不及時處理很容易萎蔫、褪色、腐爛，因此鮮豇豆采摘后需及時處理以減少損耗[2]。

泡菜是一種歷史悠久、營養豐富的乳酸發酵蔬菜制品，其有機酸含量的變化既是評價發酵工藝的重要指標，也是泡菜生產過程中重要的質量管理指標[3]。食品中廣泛存在的有機酸大多為低分子羧酸，除乙酸、乳酸、丁二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸外，還有少量的富馬酸、馬來酸、甲酸、草酸等[4-5]。這些有機酸既為食品提供特殊的風味，也作為酸性物質調節溶液pH使亞硝酸鹽發生降解[6]。目前有機酸的研究多集中在水果[7-9]，對于蔬菜中有機酸的研究甚少；且基本也只對泡菜原料中的有機酸進行研究，而對泡菜發酵液中有機酸的報道較為罕見；鮮有的幾篇也僅列出不同發酵天數有機酸的含量變化數據，并未對現象進行解釋，更未對其中的原理進行探討[10-12]。因此明確泡菜發酵過程中原料及發酵液中有機酸種類、含量變化及其對亞硝酸鹽的降解作用，為泡菜研究提供新的方向。

本試驗以新鮮豇豆為原料，試圖探索泡豇豆發酵過程中蔬菜組織和發酵液中有機酸的種類及含量變化，并比較各有機酸降解亞硝酸鹽能力大小，以期為闡明泡菜中亞硝酸鹽降解機理和生產控制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

豇豆、食鹽、玻璃壇，均購于重慶市農貿市場。

有機酸(草酸、酒石酸、蘋果酸、醋酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸)、NH4H2PO3、H3PO4、甲醇，均為色譜純；亞硝酸鹽、NaOH、(NH4)2SO4、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺，均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.2 主要儀器及設備

PB-10酸度計，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；UV-1000紫外可見分光光度計，上海大美科學儀器有限公司；5810臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；FM200高速分散機，上海弗魯克流體機械制造有限公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜腌制方法

豇豆→清洗→切分→裝壇→按1∶1加入8%食鹽水→用水密封→22 ℃恒溫發酵

每24 h取一壇進行分析，每個樣品試驗3次。

1.3.2 亞硝酸鹽測定

經預實驗測定，豇豆原料中硝酸鹽含量為426.11 mg/kg。亞硝酸含量測定參照GB 5009.33—2016[13]，采用分光光度法。吸光值y與亞硝酸鹽含量x的方程為：y=0.014 3x-0.001 8，R2=0.998 8。

1.3.3 泡菜中有機酸測定

(1)標樣配制

根據預試驗將草酸、酒石酸、蘋果酸、醋酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸8種有機酸分別配制成5種不同濃度，制成混標。

(2)樣品處理

豇豆按1∶1加超純水，制備成勻漿。分別稱取5.00 g勻漿，加入15 mL 80%乙醇-水溶液，75 ℃水浴0.5 h，冷卻至室溫，轉移至25 mL容量瓶中，超純水定容至刻度，過濾，濾液于9 000 r/min，離心30 min，上清液用氮吹儀濃縮至1.00 mL，用0.45 μm水系濾膜針頭過濾器過濾濃縮液，將濾液上機檢測[14]。發酵液直接取原液過0.45 μm水系濾膜，濾液上機檢測。

(3)測定條件

色譜柱：C18柱(Welch Materials)，250 mm×4.6 mm，5 μm。流動相：3% CH3OH，0.1mol/L KH2PO3，pH 2.8，臨用前超聲波脫氣30 min。流速0.8 mL/min，進樣量20 μL，紫外檢測波長210 nm，柱溫28 ℃。

(4)樣品定性與定量

在上述測定條件下，對比樣品測定圖譜與混標測定圖譜，通過保留時間進行定性分析。通過不同濃度的標準對照品所對應的峰面積制作標準曲線，用外標法進行定量分析。

(5)結果計算如公式(1)

(1)

式中：X，樣品中有機酸含量，mg/(100 g)；c，由標準曲線求得有機酸的濃度，μg/mL；V1，樣品最后定容體積，mL；V，提取液總體積，mL；V2，樣品進樣體積，mL；m，樣品質量，g。

1.3.4 不同有機酸降解亞硝酸能力

分別取20.00 mg草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸，加至40 mL，50μg/mL亞硝酸鹽溶液中。30 ℃水浴，每12 h取1 mL于25 mL比色管中，測定亞硝酸鹽含量。并按公式(2)計算亞硝酸鹽降解率。

(2)

式中：Y，亞硝酸鹽降解率，%；m0，未加有機酸時亞硝酸鹽含量，μg；m，加入有機酸時亞硝酸鹽含量，μg。

1.3.5 數據統計與分析

試驗所得數據均為3次試驗的平均值，采用Excel和Origin 9.0進行處理。

2 結果分析

2.1 蔬菜腌制過程中亞硝酸鹽的變化

如圖1所示,原料中亞硝酸鹽含量為1.79 mg/kg，隨著發酵的進行，蔬菜組織和發酵液中亞硝酸鹽含量均呈先升高后下降的趨勢，3 d后出現“亞硝峰”，亞硝酸鹽含量分別為27.44 mg/kg和28.92 mg/kg，隨后迅速下降，7 d后蔬菜組織和發酵液中亞硝酸鹽含量降至較低水平，分別為1.50 mg/kg和1.67 mg/kg，達到綠色食品標準(<4 mg/kg)。

圖1 蔬菜發酵過程中亞硝酸鹽含量變化Fig.1 Changes of the nitrite contents in vegetables and brine during the fermentation

2.2 有機酸標準圖譜和樣品圖譜

由圖2可以看出，采用此方法能較好地分離8種有機酸，且在15 min左右時全部有機酸被洗脫出來。

圖2 有機酸標準樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of a mixture of eight organic acids standards注：1-草酸；2-酒石酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-乙酸；6-檸檬酸；7-富馬酸；8-琥珀酸，下同。

由圖3可知發酵2 d后在蔬菜組織和發酵液中均檢測出8種有機酸，分別是草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸。發酵7 d后在蔬菜組織中檢出6種有機酸，草酸和富馬酸未檢出；發酵液中也檢出6種有機酸，富馬酸和琥珀酸未檢出(見圖4)。可見，蔬菜組織和發酵液中有機酸種類及含量隨發酵時間有明顯的變化。

a-蔬菜組織組；b-發酵液組圖3 發酵2d蔬菜組織中和發酵液中有機酸色譜圖Fig.3 Chromatogram of organic acids in vegetables and brine at the 2rd day

a-蔬菜組織組；b-發酵液組圖4 發酵7d蔬菜組織和發酵液中有機酸色譜圖Fig.4 Chromatogram of organic acids in vegetables and brine at the 7th day

2.3 發酵過程中有機酸含量變化

2.3.1 發酵過程中草酸含量變化

從泡菜發酵過程中草酸含量變化(圖5)來看，新鮮豇豆中草酸含量為225.88 mg/(100 g)，隨著發酵時間的延長，蔬菜組織中草酸含量總體呈顯著降低趨勢(P<0.01)，到發酵第5天時未被檢出。原因可能是草酸與醇類物質反應生成酯類物質，或被微生物利用生成其他物質[15]，以及計入發酵液中導致其含量降低。而發酵液中草酸含量隨著發酵的進行先升高后降低(P<0.05)，在發酵第7天，草酸含量降至29.32 mg/(100 g)。豇豆經過微生物發酵作用可顯著降低草酸含量，提高其營養價值。

圖5 發酵過程中草酸含量變化Fig.5 Changes of oxalic acid in vegetables and brine during fermentation

2.3.2 發酵過程中酒石酸含量變化

原料中酒石酸含量為76.92 mg/(100 g)，隨著發酵過程的進行，蔬菜組織中酒石酸含量發酵1 d后顯著降低(P<0.05)，再升高，發酵第3天酒石酸含量最高，為97.93 mg/(100 g)，而發酵7 d后降至49.69 mg/(100 g)(圖6)。發酵液中酒石酸含量變化呈升高后降低的趨勢(P<0.05)，發酵4 d后酒石酸含量最高，為83.71 mg/kg，發酵7 d后降至45.43 mg/(100 g)。

圖6 發酵過程中酒石酸含量變化Fig.6 Changes of tartaric acid in vegetables and brine during fermentation

2.3.3 發酵過程中蘋果酸含量變化

在泡菜中蘋果酸含量相對較高，使得泡菜的口感令人愉悅。如圖7所示,在整個發酵過程中，蔬菜組織和發酵液中蘋果酸含量顯著升高(P<0.05)，新鮮蔬菜中蘋果酸含量為28.78 mg/(100 g)，發酵7 d后為328.88 mg/(100 g)。發酵液中蘋果酸在發酵2 d后開始被檢出，然后顯著升高(P<0.05)，發酵5 d后，蘋果酸含量變化趨勢不明顯，發酵7 d后，含量為195.38 mg/(100 g)。蔬菜組織中的蘋果酸含量在整個發酵過程中較發酵液中高。

圖7 發酵過程中蘋果酸含量變化Fig.7 Changes ofmalic acid in vegetables and brine during fermentation

2.3.4 發酵過程中乳酸含量變化

從泡菜發酵過程中蔬菜組織和發酵液中乳酸含量變化(圖8)來看，原料中乳酸含量較低，為3.61 mg/(100 g)，隨著發酵的進行蔬菜組織中乳酸含量呈曲折上升趨勢。蔬菜經發酵，乳酸含量提高8倍多。乳酸酸味柔和，有后酸味，提供泡菜柔和的風味[16]。發酵液中乳酸在發酵2 d后開始被檢出，呈先升高后降低的變化趨勢，發酵6 d后乳酸含量最高，為79.13 mg/(100 g)，7 d后降至63.19 mg/(100 g)。原因可能是在發酵的初始階段，主要進行異型乳酸發酵；而在發酵中期，主要是同型乳酸發酵，該階段乳酸菌較活躍，此時可積累大量的乳酸；在發酵后熟階段，酯化反應生成酯類芳香物質，乳酸菌活性降低，乳酸含量降低[17]。

圖8 發酵過程中乳酸含量變化Fig.8 Changes oflactic acid in vegetables and brine during the fermentation

2.3.5 發酵過程中乙酸含量變化

蔬菜發酵過程中，好氣性醋酸菌將生成的乙醇在乙醇脫氫酶和氧氣的作用下先氧化為乙醛，然后再氧化為醋酸。產生的醋酸具有較強的刺激感，并具有增酸增香特性，促進食欲[18]。原料中乙酸含量較低，為7.93 mg/(100 g)。隨著發酵過程的進行，蔬菜組織和發酵液中乙酸含量顯著升高(P<0.05，如圖9)。蔬菜組織中乙酸發酵第3天增速最快，發酵6 d后，含量保持不變，為364.71 mg/(100 g)。發酵液中乙酸含量升高速率較緩，在發酵6 d后最高，為128.43 mg/(100 g)，發酵第7天，乙酸含量下降至107.66 mg/(100 g)。

圖9 發酵過程中乙酸含量變化Fig.9 Changes of acetic acid in vegetables and brine during fermentation

2.3.6 發酵過程中檸檬酸含量變化

原料中檸檬酸含量為118.02 mg/(100 g)，泡菜發酵過程中蔬菜組織中的檸檬酸含量呈先升高后降低的變化趨勢(P<0.05)。在三羧酸循環階段會積累檸檬酸，隨著發酵的繼續，部分檸檬酸被代謝，使其含量趨于平衡[19]。發酵4 d含量最高，為743.12 mg/(100 g)，7d后降至641.59 mg/(100 g)，泡菜經過發酵檸檬酸增加了4.4倍(圖10)。發酵液中檸檬酸含量在發酵前4 d增速緩慢，第5天增加較高，最后基本保持不變，最終含量為174.48 mg/(100 g)。

圖10 發酵過程中檸檬酸含量變化Fig.10 Changes ofcitric acidin vegetables and brine during fermentation

2.3.7 發酵過程中富馬酸含量變化

蔬菜組織和發酵液中富馬酸含量均呈先升高后降低的變化趨勢，發酵后期均未檢出(如圖11),發酵3d后蔬菜組織中富馬酸含量最高，為1.27 mg/(100 g)。發酵4 d后發酵液中富馬酸含量最高，為1.70 mg/(100 g)。富馬酸含量顯著下降，可能是被醋酸菌代謝利用或者在發酵的強氧化條件下被氧化降解。

圖11 泡菜發酵過程中富馬酸含量變化Fig.11 Changes of fumaric acid in vegetables and brine during the fermentation

2.3.8 發酵過程中琥珀酸含量變化

如圖12所示,蔬菜組織中琥珀酸含量隨著發酵的進行顯著增加(P<0.05)，發酵第7天含量為147.75 mg/(100 g)，比新鮮蔬菜提高了9倍左右，可能是由微生物代謝引起的。發酵液中琥珀酸含量先升高，至第3天達到最大，為28.44 mg/(100 g)，之后下降，發酵第4天及之后未被檢出。可能是由于琥珀酸是三羧酸循環的中間產物，參與發酵過程中的微生物代謝，并與亞硝酸鹽反應，以及生成微溶性鹽等導致其含量下降。

圖12 發酵過程中琥珀酸含量變化Fig.12 Changes of succinic acid in vegetables and brine during the fermentation

2.4 不同有機酸對亞硝酸鹽降解能力

如圖13所示,反應12 h草酸降解率為89.36%，其次是酒石酸83.33%，蘋果酸和檸檬酸差異不大，分別為79.30%、78.22%，富馬酸降解能力最弱，降解率為15.48%。反應72 h后，除乙酸、乳酸和富馬酸外，其他5種有機酸對亞硝酸鹽降解率均達95%以上。各有機酸降解亞硝酸鹽能力的大小順序依次為草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、富馬酸。

圖13 不同有機酸降解亞硝酸鹽能力比較Fig.13 Effect of different organic acids onscavenging rate of nitrite

3 結論與討論

豇豆發酵前期在蔬菜組織和發酵液中均檢測出8種有機酸，分別為草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸和琥珀酸；8種有機酸隨發酵時間的增加變化趨勢各不相同，發酵7 d后，蔬菜組織中檸檬酸含量最高，為641.59 mg/(100 g)，發酵液中蘋果酸含量最高，為195.39 mg/(100 g)；且各有機酸降解亞硝酸鹽能力大小順序依次為草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、富馬酸。其中，檸檬酸酸性較強，含量較高，降解亞硝酸鹽的能力較強，故推斷其在泡菜發酵過程可能對亞硝酸鹽的降解起主導作用。

本文與商景天等[10]、鄒輝等[11]和劉曉英等[12]的研究存在相似之處，但試驗結果卻差別很大。具體原因可能有以下兩點：(1)原料不同。泡菜發酵產生的有機酸種類及各有機酸含量與發酵的原料密切相關；(2)發酵時間不同。商景天等[10]的發酵時間為120 h，鄒輝等[11]、劉曉英等[12]的發酵時間為12 d，故不同的發酵時間，各有機酸含量的變化趨勢也會發生變化。本文雖與上述幾篇文章的研究內容存在相似點，但側重點有所不同。商景天等[10]、劉曉英等[12]重點研究不同條件(溫度、酸濃度、pH等)對有機酸降解亞硝酸鹽的影響，鄒輝等[11]重點測定泡白菜中的有機酸種類及它們各自對亞硝酸鹽的降解能力，但對各有機酸的含量變化只是簡單的數據羅列，并未進行深入分析。且3篇文章都只對泡菜進行研究，都未將發酵液一起對比。因此，本文借鑒前人的研究情況，并在此基礎上深入，以期為闡明泡菜中亞硝酸鹽降解機理和生產控制提供理論基礎。