生活廢棄油脂高效降解菌的篩選、鑒定及應用

史紅玲,陳夢言,劉飛,唐存多,劉鉞,姚倫廣*,闞云超*

1(南陽師范學院 昆蟲生物反應器河南省工程實驗室和河南省南水北調中線水源區(qū)生態(tài)安全重點實驗室,河南 南陽,473061)2(南水北調中線水源區(qū)水安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 南陽,473061)3(車用生物燃料技術國家重點實驗室,河南 南陽,473000)

進入新世紀以來，全球經濟經歷了飛速發(fā)展的階段，而環(huán)境污染和能源危機的形勢卻日益嚴峻[1-2]。隨著人們生活水平日益提高，含油脂生活廢水的排放也呈指數(shù)增長[3]。未經處理直接進入水體的油脂會漂浮于水體表面，影響水體的富氧及后續(xù)凈化，危害水生生態(tài)系統(tǒng)，嚴重污染周圍環(huán)境[4-5]。目前，含油脂廢水的處理方法主要有物理法、化學法和生物法。物理法和化學法由于投資大、占地廣、工藝復雜，且容易產生二次污染，實際應用較少[5]。生物法處理油脂廢水，主要利用油脂廢水中具有一定的油脂降解能力的微生物，將油脂作為碳源和能源，并通過微生物生長過程中產生的脂肪酶等降解酶系將油脂水解為甘油、脂肪酸，最終分解氧化為H2O和CO2等代謝產物[6]。生物處理過程投資小、成本低、效率高且無二次污染，現(xiàn)已成為國內外的研究熱點[7-9]，降解油脂微生物的篩選分離也逐漸成為了研究熱點[10]。

目前，丹江口庫區(qū)的產業(yè)結構調整和轉型升級得到了大力發(fā)展，來自工業(yè)的三廢污染和農業(yè)的面源污染已得到了良好控制[11-12]。然而，庫區(qū)人們日益增長的生活廢棄油脂排放，若不及時處理，一旦超過水體自凈的閾值，必將成為新增的污染源。本研究以丹江口庫區(qū)廣泛使用的大豆油為模式底物，從丹江口庫區(qū)上游支流紫氣河的水體中，篩選出了能夠高效降解當?shù)厣顝U棄油脂的土著微生物，為實現(xiàn)丹江口庫區(qū)廢棄生活油脂的生物降解奠定了基礎，對庫區(qū)的污水生物處理及水生態(tài)安全的保護也具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水樣

在丹江口庫區(qū)的馬蹬鎮(zhèn)紫氣河流域，根據(jù)生活污水的排放特點，選取了3個合適的采樣點，分別用無菌的50 mL離心管采取水樣，于冰盒保存?zhèn)浜Y。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)液、中性紅培養(yǎng)基及選擇培養(yǎng)液參照孟靜[10]的方法，根據(jù)當?shù)厥秤糜褪褂玫奶攸c略作修改。富集培養(yǎng)液：NaCl 5 g，蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，福臨門大豆油4 mL，自然pH，用水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min；油脂中性紅培養(yǎng)基：NaCl 5 g，KH2PO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，K2HPO41.5 g，(NH4)2SO41.0 g，瓊脂20 g，Tween 80 20 mL，福臨門大豆油10 mL，1.6%中性紅水溶液1 mL，蒸餾水定容至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min；選擇培養(yǎng)液：蛋白胨1 g，NH4NO30.2 g，K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1g，豆油1 mL，pH 7.2～7.4，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑與試劑盒

Axygen?AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit，Axygen公司；Premix Prime STAR HS試劑盒，大連寶生物；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2 油脂降解菌的馴化

將采集的水樣樣品充分混合，取5 mL加入裝有45 mL無菌水和無菌玻璃組的150 mL三角瓶內，置于搖床上，200 r/min轉速充分振蕩10 min，然后取5 mL加入35 mL富集培養(yǎng)液中，并在40 ℃，200 r/min，自然pH條件下培養(yǎng)，每天觀察，如果發(fā)現(xiàn)油脂降解得好就補加少量大豆油，每4 d轉接10 mL培養(yǎng)物至30 mL新的培養(yǎng)基中，以促進油脂降解菌的生長，此馴化過程持續(xù)2個月。

1.3 油脂降解菌的篩選

1.3.1 初篩

將馴化后的菌液梯度稀釋后涂布于油脂中性紅培養(yǎng)基上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱進行平板培養(yǎng)，每12 h觀察培養(yǎng)基中菌落的生長情況。在相同培養(yǎng)條件下生長的菌株，單菌落生長的比較大而且顏色鮮紅，則證明該菌株能在此條件下良好地生長，且具有降解油脂的能力，從而初步測定出各菌株對油脂的降解情況，并以此來判斷待測菌株對油脂的降解能力。

1.3.2 復篩

參照張印等[13]方法，采用紫外分光光度法測定油脂降解率，來對油脂降解菌進行復篩，獲得油脂降解能力最強的菌株，并進行編號命名，以供下一步的鑒定。

1.3.3 油脂降解率的測定

將大豆油溶解于石油醚，配制成10%的標準液，然后分別用石油醚配制成體積分數(shù)為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、4%和5%的工作液。然后在205 nm處測定各濃度下油脂的OD值，并繪制標準曲線，得到回歸方程。通過方程式(1)計算油脂降解率。

(1)

式中:C0,培養(yǎng)基中含油量;C1,發(fā)酵液中含油量。

1.4 油脂降解菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)和生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》，將目標菌株進行形態(tài)和生理生化特征鑒定。

1.4.2 目的菌株的16 S rDNA的擴增及分析

細菌基因組DNA的提取參照試劑盒的說明書進行，并用NanoDrop 2000C超微量分光光度計測基因組的濃度。利用細菌16S rDNA擴增通用引物27F和1492R，以目的菌種基因組DNA為模板進行PCR擴增，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增后的PCR產物純化后由上海生工生物工程有限公司測序，將得到的16S rDNA序列結果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫并進行BLAST比對，找到并下載典型的菌株序列與實驗菌株的序列用Clustal X 2.0軟件進行同源性分析，并用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 油脂降解條件的研究

1.5.1 初始pH的影響

丹江口庫區(qū)水體的pH值一般在7.8～8.2[14]，為了考察不同的初始pH值對油脂降解的影響以及目標菌株對庫區(qū)pH的適應性，本文首先對初始pH值做了單因素分析。以選擇培養(yǎng)液為基礎，調整油脂初始濃度到5%，菌種接種量10%，分別選定pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0作為初始值，在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)36 h，然后分別測定各pH值下的油脂降解率。

1.5.2 培養(yǎng)時間的影響

為了考察培養(yǎng)時間對油脂降解情況的影響，以選擇培養(yǎng)液為基礎，調整油脂初始濃度到5%，菌種接種量10%，pH值為7.0，在37 ℃、150 r/min下分別培養(yǎng)0、6、12、18、24、30和36 h，然后分別測定各培養(yǎng)時間線下的油脂降解率。

1.5.3 培養(yǎng)溫度的影響

丹江口庫區(qū)水體的水溫常年在6～27 ℃[14]，為了考察不同的培養(yǎng)溫度對油脂降解的影響以及目標菌株對庫區(qū)溫度的適應性，本文也對溫度做了單因素分析。以選擇培養(yǎng)液為基礎，調整油脂初始濃度到5%，菌種接種量10%，pH值為7.0，分別在5、10、15、20、25、30和35 ℃、150 r/min下培養(yǎng)36 h，然后分別測定各溫度下的油脂降解率。

1.5.4 目標菌株對其他常見油脂的降解

丹江口庫區(qū)居民的生活油脂主要包括大豆油、菜籽油和花生油，為了進一步考察目標菌株的應用潛力，本文繼續(xù)考察了目標菌株對菜籽油和花生油的降解效果。以選擇培養(yǎng)液為基礎，分別調整菜籽油和花生油初始濃度到5%，菌種接種量10%，pH值為7.0，在35 ℃、150 r/min下培養(yǎng)36 h，每隔4 h取樣測定它們的油脂降解率。

2 結果與分析

2.1 油脂降解菌的馴化與分離篩選

用大豆油對菌種進行為期2個月的馴化，然后用中性紅油脂培養(yǎng)基進行平板分離，獲得了一株油脂降解能力較強的菌株。如圖1所示，1號菌株的菌落周圍有明顯的水解圈，且明顯大于其他菌落，另外菌落中間也有紅色斑點出現(xiàn)，表明該菌株水解油脂的潛力較大[10,15-16]，命名為NY-201801。用紫外吸收測定油脂降解率的方法進行復篩，測得NY-201801菌株對5%油脂的水解率能達到50%以上，進一步證實該菌的確具有降解油脂的能力。

圖1 生活油脂降解菌的平板分離Fig.1 Plate isolation of degrading household lipid

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)特征及生理生化鑒定

NY-201801菌株為革蘭氏陰性菌，桿狀，菌落呈圓形，菌落表面在基礎培養(yǎng)基上遷徙生長。生理生化試驗結果如表1所示。

表1 NY-201801菌株的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of NY-201801

注：“+”表示具備此特征；“-”表示不具備此特征。

結果表明該菌株具有尿素酶活性，沒有β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性，能夠分解含硫有機物生成，其生理生化特性與孟靜等[10]報道的變形桿菌較為類似。利用高分辨率場發(fā)射掃描電鏡對NY-201801菌株進行電鏡分析，結果如圖2所示。菌體長度約1 μm、直徑約0.4 μm，鞭毛少且短。

圖2 NY-201801菌株的場發(fā)射掃描電鏡照片F(xiàn)ig.2 Field emission scanning electron microscope photograph of NY-201801

2.2.2 16 S rDNA測序鑒定

NY201801菌株經過16S rDNA測序(Accession No.:MK392127)，將序列在NCBI中進行BLAST分析，用ClustX 2.0和Mega 6.0軟件繪制菌株NY-201801系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。結果表明菌株NY-201801與Proteusmirabilisstrain FC2969相似度達到99.9%，結合形態(tài)學和生理生化特征，可以初步鑒定為NY-201801菌株為Proteusmirabilis[10]。

圖3 菌株NY-201801系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain NY-201801

2.3 油脂含量與OD205的相關性

為了考察油脂含量與OD205的線性關系，本研究分別測定了0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、4%和5%大豆油在205 nm下的紫外吸收值。利用Origin 9進行線性擬合，曲線如圖4所示。

圖4 油脂含量與OD205的相關性Fig.4 The correlation between oil content and OD205

結果顯示，相關系數(shù)達到0.999 8，表明在油脂濃度為0.5%～5%，油脂濃度與OD205成良好的線性相關，利用紫外吸收法能夠準確地測定油脂的濃度。

2.4 pH值對油脂降解率的影響

為了考察ProteusmirabilisNY-201801菌株對丹江口庫區(qū)水體pH的適應能力，本研究首先研究了不同pH值對油脂降解率的影響，結果如圖5所示。結果顯示，該菌株在庫區(qū)水體pH值范圍內[14]，對油脂的降解率均能達到90%以上，顯著高于前人報道的水平[3,17]。同時，該菌株對庫區(qū)水體pH值具有良好的適應能力，也意味著它在降解庫區(qū)生活油脂方面具有更大的應用潛力。在低pH值下，ProteusmirabilisNY-201801對油脂的降解率較低，可能原因為該菌產生的脂肪酶的最適pH值偏堿性，在低pH值下不利于脂肪酶發(fā)揮水解作用。而且油脂的水解本身也是一個產酸的過程，故較高的初始pH值更利于反應的進行。

圖5 pH對降解率的影響Fig.5 The effect of pH on degradation rate

2.5 時間對油脂降解率的影響

為了考察ProteusmirabilisNY-201801對油脂的降解效率，研究了不同反應時間下的油脂降解率，結果如圖6所示。前6 h處在菌體生長和脂肪酶的積累時期，油脂降解率增加的趨勢較緩，隨著時間的延長，油脂降解率逐漸提升，到36 h時降解率達到95%。與前人的研究相比，在相同的菌種添加量、初始油脂濃度及作用時間等條件下，ProteusmirabilisNY-201801對油脂的降解率明顯占優(yōu)勢[9-10]，也表明它具有更大的應用前景。

圖6 時間對降解率的影響Fig.6 The effect of time on degradation rate

2.6 溫度對油脂降解率的影響

為了考察ProteusmirabilisNY-201801菌株對丹江口庫區(qū)水體水溫的適應能力，本研究考察了不同溫度對油脂降解率的影響，結果如圖7所示。在庫區(qū)水體溫度6～27 ℃，溫度越高，油脂的降解率也越高。這歸因于溫度能夠正調節(jié)微生物的生長速率、脂肪酶的活性，以及油脂在水中的溶解度及擴散能力。在菌體合適的生長溫度(35 ℃)下，降解率可以高達92%；在夏季平均水溫(25 ℃)下，ProteusmirabilisNY-201801對油脂的降解率可以達到50%以上；在10 ℃時，還有一定的降解能力；溫度低于最低水溫(5 ℃)時，對油脂幾乎沒有降解能力。進一步表明，來源于丹江口庫區(qū)的土著微生物ProteusmirabilisNY-201801對庫區(qū)的環(huán)境具有良好的適應能力，在處理庫區(qū)生活廢棄油脂時較其他微生物更具優(yōu)勢。

圖7 溫度對降解率的影響Fig.7 The effect of temperature on degradation rate

2.7 Proteus mirabilis NY-201801對其他油脂的降解

為了進一步考察ProteusmirabilisNY-201801菌株的應用潛力，圍繞丹江口庫區(qū)居民日常生活油脂的使用特點，本研究繼續(xù)考察了ProteusmirabilisNY-201801菌株對菜籽油和花生油的降解效果，菌種接種量10%，pH值為7.0，在35 ℃、150 r/min下培養(yǎng)36 h，降解率隨時間的變化如圖8所示。結果顯示，在培養(yǎng)初期，ProteusmirabilisNY-201801菌株對花生油和菜籽油的降解較快，可能歸因于ProteusmirabilisNY-201801菌株中水解花生油和菜籽油的脂肪酶水平較高，在初期降解花生油和菜籽油的效果較好。12 h后，ProteusmirabilisNY-201801菌株對大豆油的降解率有顯著提高，可能歸因于這一段時間內偏愛大豆油的脂肪酶得以大量表達，表現(xiàn)出了對大豆油更強的降解能力。當培養(yǎng)至36 h，ProteusmirabilisNY-201801菌株對3種供試油脂均有較好的降解效果，降解效果最好的大豆油的降解率可達90%以上，效果最差的花生油的降解率也接近70%，表明ProteusmirabilisNY-201801菌株具有較好的油脂種類的普適性，具有較大的應用潛力。

圖8 Proteus mirabilis NY-201801對不同油脂的降解效率Fig.8 The degradation efficiency of Proteus mirabilis NY-201801 for different oils

3 討論

隨著生活水平和飲食結構的改變，人們對油脂的消耗量日益增長，過多的生活廢棄油脂進入水系，會降低水系的自凈能力、破壞水生生態(tài)系統(tǒng)[5]。在南水北調中線工程干渠通水以后，進入庫區(qū)參觀的游客日益增多，顯著增加了庫區(qū)餐廚垃圾的排放，增加了水體自凈的壓力。生活油脂大多為長鏈的甘油三脂，油脂的生物降解主要依賴于微生物產生的脂肪酶來逐漸水解成短鏈的脂肪酸和甘油[15]。篩選高效的油脂降解菌對生活油脂進行回收和利用，已成為許多科研工作者所關注的焦點[10,18-19]。

土著微生物對當?shù)丨h(huán)境具有更好的適應性，在環(huán)境治理和生態(tài)修復方面也具有更大的優(yōu)勢和應用潛力[20-21]。本研究利用大豆油為目標底物對庫區(qū)紫氣河水中的微生物進行馴化，然后利用中性紅油脂平板篩選出了一株具有較強油脂降解能力的土著微生物NY-201801，油脂降解能力明顯優(yōu)于已報道的微生物[6,18-19]。同時該菌也具有巨大的挖掘高活性脂肪酶的潛力，有待下一步深入研究。經生理生化和分子鑒定，NY-201801與Proteusmirabilis的相似性最高[10]，16S rDNA的序列同源性高達99.9%，故將其命名為ProteusmirabilisNY-201801。

此外，考察了pH值對ProteusmirabilisNY-201801降解油脂效率的影響，結果顯示該菌株對庫區(qū)水體pH值良好適應能力，在庫區(qū)水體pH值范圍內對油脂均具有較高的降解率，也意味著它在降解庫區(qū)生活油脂方面具有更大的應用潛力，進一步體現(xiàn)了土著微生物在治理當?shù)丨h(huán)境中的優(yōu)勢。同時，考察了溫度對油脂降解率的影響，ProteusmirabilisNY-201801對環(huán)境溫度的適應性較廣，在15 ℃下反應36 h仍能達到40%的降解率，能夠適應庫區(qū)大部分時間的水溫，較其他已報道的菌株更具應用優(yōu)勢。但該菌株在5 ℃對油脂幾乎沒有降解能力，也有可能是低溫下菌株不能良好的生長，也有可能是產生的脂肪酶在低溫下活性極低，有待下一步的驗證和改造。

4 結論

本研究針對丹江口庫區(qū)生活油脂的特點，對紫氣河流域的油脂降解微生物進行了馴化、篩選和鑒定，并對油脂降解的條件進行了初步優(yōu)化，得出了如下結論：

(1)從丹江口庫區(qū)紫氣河流域篩選到了一株能夠高效水解大豆油的微生物，編號為NY-201801，經鑒定該菌株的生理生化特征及16S rDNA序列與奇異變形桿菌Proteusmirabilis最為接近，故將其命名為ProteusmirabilisNY-201801。

(2)ProteusmirabilisNY-201801具有較強的油脂降解能力，5%油脂初始濃度，菌種接種量10%，pH值為7.0，在35 ℃、150 r/min下培養(yǎng)36 h，油脂降解率可以達到92%。

(3)ProteusmirabilisNY-201801能夠較好地適應丹江口庫區(qū)水體的pH值和溫度等條件，具有較好的環(huán)境適應性，在庫區(qū)最高水溫的條件下，對5%油脂的降解率可以達到50%，同時ProteusmirabilisNY-201801對菜籽油及花生油也具有較好的降解效果，具有較大的應用前景。