清香小曲白酒新工藝中微生物及環境因子對酒體風味變化的影響

唐潔，陳申習，林斌，夏金陽，楊強*

1(勁牌有限公司，湖北 大冶，435100)2(勁牌研究院，湖北 大冶，435100)3(中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶，435100)

傳統白酒釀造過程中存在著設備落后、勞動強度大、生產效率低、工藝控制粗放等問題，隨著經濟的發展和技術的創新，釀酒行業開始采用機械化、自動化、智能化和信息化等手段不斷地促使傳統白酒釀造模式升級[1-4]。機械化釀酒工藝雖然在酒曲應用和釀造流程方面與傳統工藝相似，但因其獨特的釀造設備以及釀造環境，導致生產出來的原酒相比較傳統工藝，在風味組成上具有顯著性差異。解析機械化釀酒工藝過程中風味物質形成和積累的驅動因子將有助于了解機械化釀酒工藝風味物質形成規律，最終達到機械化釀造出的原酒酒質與傳統工藝保持一致甚至更優的目標。

作為白酒發酵過程中最重要的生物因子——微生物，代謝酒醅中淀粉、蛋白質等物質，將其轉化為白酒的主要成分及微量風味物質。白酒發酵過程中微生物群落演替和結構改變會驅動風味物質組成發生變化，引起從乙醇到乙酸等一系列呈香物質生成和轉化[5]。同樣，微生物生長代謝引起了窖內酒醅理化指標呈現一定規律的變化，同時酒醅中成分改變也引起微生物群落生存環境和群落結構的相應改變，使窖內優勢菌群逐漸呈現穩定狀態[6]，進而影響酒醅中風味物質代謝和積累。可見微生物和環境因子是影響白酒中風味物質形成的重要因素[7-8]。隨著勁牌小曲白酒機械化新工藝近年不斷完善和成熟，原酒品質得到了極大的提高。但通過近幾年的原酒生產數據發現，原酒的出酒率和酒質隨著釀造原料和季節的變化而產生差異。因此，揭示小曲清香型白酒機械化工藝過程中風味物質形成的驅動因子，不僅有助于探索清香型白酒穩定生產工藝，更能進一步了解小曲清香型白酒發酵過程中微生物變化及風味產生機理。以往研究大多集中在濃香型或大曲清香型酒醅中微生物、理化指標和風味成分之間的研究[9-20]，而涉及小曲清香型白酒的研究甚少[4,21-25]。

本文以正常發酵清香型小曲機械化車間酒醅為研究對象，分析不同發酵時期酒醅發酵過程中微生物動態變化，以及風味物質生成的過程，并結合酒醅環境理化參數的變化，揭示了清香小曲白酒新工藝中微生物及環境因子對酒體風味變化的影響，以期指導實際生產，使原酒中各主要香味成分含量波動較小，為機械化工藝改進和酒質的不斷提升提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集

樣品采集于勁牌有限公司機械化白酒發酵車間酒醅，目前車間糖化時間1 d，發酵周期為15 d，一個發酵批次為16 d。選擇發酵0～15 d每天固定一個發酵槽車連續取樣。為了獲得不同時間發酵酒醅中各參數的變化，先后于2015年11～12月、2016年1～4月(2月除外)對同一個車間發酵過程中酒醅連續跟蹤取樣，每個月1個發酵批次，每次取樣量為1 500 g，樣品混勻后采用封口塑料袋密封后置于4 ℃冰箱或冰柜中冷藏備用，冷藏時間不超過1周，且用于微生物平板計數的樣品為當天采集的樣品。

1.1.2 主要試劑及儀器

蛋白胨、酵母浸粉、無水葡萄糖、牛肉浸膏、乙酸鈉、吐溫-80、瓊脂粉、MgSO4、MnSO4、CuSO4、酒石酸鉀鈉、NaOH、次甲基藍、亞鐵氰化鉀等，國藥集團化學試劑(北京)有限公司。

恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司；凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司；便攜式酒精度密度計，奧地利安東帕公司；氣相色譜儀，美國安捷倫公司；精密pH計，美國Mettle-Toledo公司。

1.1.3 培養基

酵母總數計數培養基為YPD培養基(g/L)：酵母浸粉10，葡萄糖20，蛋白胨20，瓊脂粉20，青霉素0.5，1×105Pa滅菌30 min。

細菌總數計數培養基為MRS培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉浸膏10，酵母浸粉5，葡萄糖5，乙酸鈉5。檸檬酸二銨2，MnSO4·7H2O 0.05，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO42，瓊脂20，吐溫80體積分數0.1%，pH 6.8，1×105Pa滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 微生物總數平板計數

稱取10 g酒醅，置于含90 mL無菌水的三角瓶中，加入玻璃珠，搖床150 r/min振蕩30 min，使酒醅與水充分混合，吸取1 mL菌懸液進行梯度稀釋后，取200 μL進行平板涂布，其中細菌計數采用傾注倒平板法。酵母和細菌分別放置于30和37 ℃培養箱中進行培養，培養2～3 d后，采用菌落記號方式進行酵母和細菌單菌落數的統計。

1.2.2 酒醅理化指標的檢測

利用常規方法分析檢測酒醅中水分、酸度、淀粉、還原糖、氨基酸態氮和粗蛋白，具體步驟參照文獻[26]。

1.2.3 酒醅風味物質分析

稱取1 000 g酒醅于磨口三角瓶內，模擬車間水蒸氣蒸餾收集前段100 mL餾出液進行分析，溜出液用便攜式密度計測定酒精度數，利用氣相色譜儀檢測微量成分組成及含量。氣相色譜具體方法見文獻[27]。

1.2.4 數據分析

利用SPSS 19.0 統計軟件對酒醅微生物總數與各理化指標、風味物質進行Pearson相關性分析，|r| >0.7 且P<0.05 代表高度顯著性相關。為了揭示不同時期酒質整體的變化，采用R語言中Vegen模塊[28]對不同批次酒醅風味物質進行了主成分分析。同時對環境因子、酒醅微生物和酒醅風味物質之間相關性進行了冗余分析，并進了蒙特卡洛置換檢驗，以解釋環境因子對酒醅發酵過程中微生物的影響以及環境因素、酒醅發酵過程中微生物對風味物質的影響。

2 結果與分析

2.1 酒醅發酵過程中酵母和細菌總數的動態變化

酒醅發酵過程中酵母總數的動態變化見圖1，酵母總數在整個發酵過程中呈先上升后下降的趨勢。在發酵2～4 d，酵母數量達到峰值，最高為108CFU/g酒醅。發酵前期由于霉菌的糖化作用，使淀粉轉換為大量能被酵母利用的糖類，所以酵母繁殖較快；發酵中后期，由于氧氣的消耗和營養物質的降低，酵母的生長繁殖受限制，數量逐漸降低，最后穩定在106CFU/g酒醅。

圖1 酒醅發酵過程中酵母的動態變化Fig.1 Dynamic change of yeast number in fermented grains

前期研究發現，清香型小曲白酒發酵過程中乳酸菌為主要的優勢菌，酒醅發酵中后期乳酸菌占了90%[4]，故本次細菌總數計數以乳酸菌為主。酒醅發酵過程中細菌總數的動態變化如圖2所示，發酵前期細菌總數進入一個遲滯期，發酵中后期才呈緩慢上升趨勢。這是由于前期酒醅溫度過低，加之酵母的快速增殖，細菌生長繁殖停緩；發酵中后期，溫度上升，此時還原糖被酵母大量消耗，滲透壓下降，加上酵母數量的減少，使釀造環境適宜細菌快速繁殖，所以細菌總數快速上升，最后穩定在107CFU/g酒醅。

圖2 酒醅發酵過程中細菌的動態變化Fig.2 Dynamic change of bacteria number in fermented grains

2.2 酒醅發酵過程中理化指標的變化

酒醅中水分不足會影響微生物生長發酵，降低出酒率；水分過多致使細菌生長旺盛從而使酒醅易酸化，影響酒質，因此要合理的控制酒醅中的含水量。由圖3可知，發酵過程中酒醅的含水量整體呈現上升趨勢，水分在60%～75%。發酵0～4 d酒醅水分上升較快，發酵4 d后水分上升緩慢，逐步至一個穩定的狀態。酒醅中水分的增加可能與酒醅中淀粉、蛋白質等大分子物質在微生物作用下逐步代謝為醇、醛、酸、酯等小分子物質，在各種生理生化反應中，同時產生大量的水分[29]有關。

圖3 酒醅發酵過程中水分的動態變化Fig.3 Dynamic change of water content in fermented grains

酸度是酒醅中所有酸性成分的總量，一定程度上反映了酒醅微生物生長代謝的變化情況。酒醅中的酸度不僅能夠影響微生物的生長代謝，還是白酒中主要的呈味物質和香氣成分的前體物質。適宜的酸度有利于酒醅糊化、糖化作用，還可以抑制有害微生物的污染[19]。如圖4可知，發酵過程中酸度的變化呈整體緩慢上升的趨勢，酸度在0.4～1 g/L。發酵前期，上升較緩慢；發酵中后期，相對平穩；發酵后期，酸度上升較快，這可能與中后期產酸細菌生長繁殖較活躍有關。

蛋白質是白酒生產過程中微生物必需的氮源，其水解產物游離氨基酸是酵母生長、繁殖的重要物質基礎，同時游離氨基酸與糖發生的美拉德反應是谷氨酸等眾多香味成分的前驅物質，對后期白酒品種、產量和質量有很大影響。菌體在生長過程中菌體蛋白水解為氨基酸和氨態氮(結構氨基酸在酵母等菌體生長發酵后期，由于原料減少，部分自溶、自發酵，釋放成為游離氨態氮)，成為入窖發酵風味成香物質的前趨物質或本身就是呈香呈味物質。但是過量的蛋白所產生氨基酸便會提高酒體中高級醇的含量[30]。

圖4 酒醅發酵過程中酸度的動態變化Fig.4 Dynamic change of acidity in fermented grains

由圖5可知，酒醅發酵過程中氨基酸態氮呈先下降后上升的趨勢，發酵0～3 d氨基酸態氮呈下降趨勢，這與此時期酵母快速增殖、以氨基酸態為氮源消耗氨基酸態氮有關。發酵3 d后酵母數量下降，此時氨基酸態氮含量逐漸穩步上升，酒醅中氨基酸態氮含量大都在0.2～0.8 g/kg。由圖6可知，酒醅發酵過程中粗蛋白呈逐步上升的趨勢，粗蛋白含量絕大部分在15%～30%。其中發酵0～3 d，酒醅中粗蛋白含量快速增加，發酵3 d后，粗蛋白處于一個平穩的狀態，波動不大。

圖5 酒醅發酵過程中氨基酸態氮的動態變化Fig.5 Change of amino acid nitrogen in fermented grains

圖6 酒醅發酵過程中粗蛋白的動態變化Fig.6 Change of crude protein in fermented grains

酒醅中微生物代謝產生酒精需要有足夠的淀粉轉化成微生物可以直接利用的碳源，因此淀粉含量是酒精發酵的物質基礎。淀粉糖化和發酵速度保持在相對平衡的狀態，才能夠保證酒醅發酵正常進行。由圖7可知，不同時期淀粉含量變化一致，均是呈逐漸降低的趨勢。其中酒醅發酵前期(發酵前3～4 d)淀粉含量迅速下降，發酵中后期淀粉含量呈緩慢下降趨勢。發酵前期酒醅中含氧量較多，霉菌分泌的酶類將淀粉轉化為酵母可以利用的還原糖類，為酵母的快速增殖提供碳源，從而使淀粉含量快速下降。發酵中后期，酒醅中乙醇濃度和酸度的增加，會影響微生物的生長代謝，從而使淀粉消耗速度變得逐步平緩。

圖7 酒醅發酵過程中殘余淀粉的動態變化Fig.7 Change of starch content in fermented grains

酒醅中還原糖由淀粉酶水解淀粉而生成，還原糖既可以為微生物的生長提供能量，同時又被酵母利用生成酒精，酒醅中還原糖濃度的變化，一定程度上反映了糖化與發酵速度的平衡和協調關系。酒醅中殘糖含量的多少，直接反映窖內酒醅發酵正常與否[18]。酒醅中還原糖含量變化見圖8，還原糖在發酵1 d時達到最大，這是由于淀粉酶水解淀粉產生大量的還原糖，而此時酵母數量還未快速增加，所以還原糖含量有所積累。隨著酵母數量的快速增加，需要還原糖作為碳源生長，故發酵1～3 d還原糖含量快速降低。發酵中后期由于酵母數量較少，加上酒醅中環境的變化，使還原糖含量的降幅逐漸趨于穩定。

圖8 酒醅發酵過程中還原糖的動態變化Fig.8 Change of reducing sugar in fermented grains

2.3 酒醅發酵過程中主要風味物質的變化

酒醅中的酒精含量是微生物代謝產生的，由圖9可知，整個發酵過程酒醅中的酒精含量是逐漸增加的。發酵0～1 d增幅較小，發酵1～3 d快速增加；隨著發酵時間的延長，發酵中后期酒精含量增幅較少，逐漸趨于平穩。且酒醅中酒精含量最高不超過60% vol。發酵前期由于氧氣的大量存在，導致酵母以生長繁殖為主，故酒精含量較低；發酵中后期，由于氧氣的消耗，酵母以無氧呼吸為主，產生大量的酒精。

圖9 酒醅發酵過程中酒精含量的動態變化Fig.9 Change of alcohol content in fermented grains

白酒中雜醇油(異丁醇和異戊醇的總和)主要是在酒精發酵過程中產生的，雜醇油含量過高會對人體造成傷害，還給酒的風味帶來邪雜味，它是中國白酒苦味或澀味的主要來源之一，亦是造成我國白酒出現白色渾濁的原因之一[21]。正是由于雜醇油是酵母代謝產乙醇的副產物，故酒醅中雜醇油含量的變化與酒精含量變化基本保持一致。如圖10所示，雜醇油含量隨著發酵的進行呈逐漸增大的趨勢，發酵前期增長較快，發酵中后期趨于平緩，變化幅度不大。

圖10 酒醅發酵過程中雜醇油含量的動態變化Fig.10 Change of fusel oils content in fermented grains

乙醛是酵母乙醇發酵的中間產物，其含量的變化主要與酵母菌種類和發酵條件相關。適量乙醛可能成為構成白酒香氣的成分，但超過一定數量也會使白酒綜合品質下降，同時可能有對人體害[31]。由圖11可知，酒醅發酵過程中乙醛呈先增加后下降最后趨于穩定的趨勢。發酵前期，乙醛含量迅速升高，這與酵母快速生長有關。發酵中期，酵母數量快速下降，導致乙醛含量迅速下降。發酵末期，此時酒醅中含糖量趨于零，酵母數量緩慢降低到達平穩期，致使乙醛含量緩慢降低。

圖11 酒醅發酵過程中乙醛含量的動態變化Fig.11 Change of acetaldehyde content in fermented grains

乙酸乙酯是清香型小曲白酒的主體香氣成分，其含量高低很大程度決定著清香型白酒的質量及風格。酒醅中乙酸乙酯含量變化呈逐步累積增加的趨勢(圖12)，發酵前期增加較快，發酵中后期趨于穩定。說明乙酸乙酯的合成代謝，在發酵初期已經開始，隨著乙醇與乙酸的積累，合成代謝速率有所增加。發酵中后期由于酯的分解作用，導致了酒醅中積累乙酸乙酯的速率下降，所以發酵中后期，乙酸乙酯含量趨于穩定。

圖12 酒醅發酵過程中乙酸乙酯含量的動態變化Fig.12 Change of ethyl acetate content in fermented grains

為了進一步解析不同時期酒質的變化，本文對不同批次酒醅中的6種主要風味物質(甲醇、乙醛、正丙醇、乙醇、乙酸乙酯和雜醇油)進行了主成分分析。主成分分析結果顯示2015年和2016年5個批次的酒醅樣品中風味物質的點并未明顯區分開來(圖13)，這表明不同時期的不同批次的酒醅風味物質之間并沒有顯著的差異，可見在小曲清香白酒新工藝條件下，不同時期白酒風味物質雖然有著波動變化，但仍呈現出相對較為穩定的趨勢。而同一批次酒醅隨著微生物發酵進行，其中的風味物質之間表現顯著的變化。

圖13 不同時期酒醅風味物質的主成分分析Fig.13 Principal component analysis of flavor in fermented grain of different period

2.4 環境因素對酒醅發酵過程中微生物的影響

為了揭示酒醅發酵過程中影響微生物變化的環境因素，利用冗余分析(redundancy analysis,RDA)并采用蒙特卡洛對6個環境因子進行了置換檢驗。冗余分析結果顯示環境因素解釋了酒醅微生物群落動態變化的32.33%，蒙特卡洛檢驗結果顯示氨基酸態氮、還原糖、粗蛋白(P<0.01)和水分(P<0.001)是影響酒醅發酵過程中微生物群落變化重要因素。其中氨基酸態氮、粗蛋白和水分與細菌總數、酵母總數呈負相關，而還原糖與微生物群落呈正相關(圖14)。

Y-酵母；B-細菌；R-還原糖；S-淀粉；C-粗蛋白；A-氨基酸態氮；W-水分；Ac-酸度圖14 酒醅微生物結構和環境因子之間冗余分析Fig.14 Redundancy analysis of microbes and environmental factors in fermented grain

因此酒醅中氨基酸態氮、還原糖、粗蛋白和水分變化推動著酒醅中微生物演替。從相關性分析中也可以看出，酸度對酵母群落變化有著顯著影響，其含量與酒醅中酵母的數量呈顯著負相關(R=-0.204，P<0.05)，隨著酒醅中酸度在發酵后期逐漸上升，會抑制酵母的繁殖，有利于后期酵母將酒醅中糖類轉化為酒精(表1)。

表1 環境因素與酒醅微生物和風味物質之間的Pearson相關性Table 1 Pearson correlation between microbes,flavor and environmental factors in fermented grain during fermentation process

注:*:P<0.05，**:P<0.01。

2.5 環境因素和酒醅微生物對風味物質的影響

為了解析影響發酵過程中酒質變化的因素，分析了酒醅風味物質與環境因子和酒醅微生物的相關性，Pearson相關系數顯示還原糖、淀粉、粗蛋白、氨基酸態氮和酸度與雜醇油、正丙醇和酒度呈顯著性相關(P<0.05)，水分與正丙醇和酒度呈顯著性相關(P<0.05),乙酸乙酯則與淀粉、粗蛋白和氨基酸態氮顯著相關，而乙醛和甲醇含量與環境因子之間相關性不具有統計學意義。在微生物方面，酵母與乙醛、酒度和甲醇之間顯著相關(P<0.05)，而細菌與主要的風味物質含量之間相關性不顯著。同樣冗余分析結果顯示環境和微生物因素共解釋了酒醅風味物質38.44%的變化。蒙特卡洛檢驗結果顯示水分(P<0.05)、酵母、還原糖(P<0.01)和淀粉(P<0.001)是影響酒醅中風味物質的重要因素，推動不同發酵時期風味物質組成以及含量發生變化(圖15)。

Y-酵母；B-細菌；R-還原糖；S-淀粉；C-粗蛋白；A-氨基酸態氮；W-水分；Ac-酸度；E-乙酸乙酯；F-雜醇油；N-正丙醇；Ace-乙醛；Al-酒度；M-甲醇圖15 酒醅風味物質與環境因子和微生物之間冗余分析Fig.15 Redundancy analysis of flavor,microbes and environmental factors in fermented grain

作為白酒微生物重要組成的乳酸菌在分析中并沒有呈現出對風味物質有重要貢獻。這可能是由于乳酸菌的主要產物—乳酸揮發性較弱，蒸餾后進入白酒中的比例較低，且平板計數也存在誤差，因此在本次實驗中細菌數量與酒醅酸度未呈現出顯著性相關。

3 結論與討論

小曲清香型白酒機械化生產工藝作為白酒生產新工藝，區別于傳統白酒釀造，實現了全程機械化，信息化，現代化，有效地確保釀造工藝穩定性。在機械化白酒釀造中，作為重要催化劑的微生物，處在不同于傳統白酒開放式生產環境下，群落動態將會出現其獨特變化，同樣微生物代謝產生的風味物質也隨之形成其特有變化趨勢[11,32]。因此開展釀酒微生物、環境和白酒風味品質之間相互作用的研究將有助于解析機械化白酒生產過程中風味物質形成機理。

對2015年和2016年共5個批次酒醅研究顯示不同時期酒醅各項指標變化趨勢相似，進一步表明了新工藝的相對穩定性。冗余分析結果表明，環境因素是影響新工藝酒醅中微生物群落變化的重要因素，酒醅中氨基酸態氮、還原糖、粗蛋白和水分變化推動著酒醅中微生物演替，尤其是在酵母類群的方面。酒醅發酵過程中還原糖和氨基酸態氮作為酵母可以利用的碳、氮源，為發酵前期酵母快速增殖提供了營養物質，因此還原糖和氨基酸態氮在發酵前期(0～3 d和1～3 d)含量呈現下降趨勢。乳酸菌作為清香型白酒酒醅中優勢微生物類群，在發酵過程中數量較為穩定，可以代謝產生乳酸、乙酸等，維持酸性釀造環境，同時為其他發酵微生物提供了營養物質和風味化合物的前體物質[33]。

環境因子和微生物是驅動酒醅風味物質生成的重要因素[34]。李小龍和王鵬等對濃香型和芝香型白酒發酵過程中微生物群落演替進行研究，發現微生物代謝導致的化學因素改變是群落演替的關鍵推動力[7-8]。隨著釀造微生物群落結構改變，其代謝產生的風味物質也隨之改變。本研究結果顯示環境因子(水分、還原糖和淀粉)和酵母是影響機械化清香型小曲白酒酒醅中風味物質的重要因素，推動不同發酵時期風味物質組成以及含量發生變化。清香型小曲白酒釀造過程中，高粱中的淀粉作為微生物代謝的重要底物，被微生物分解轉化為還原糖。釀酒酵母和產酯酵母、乳酸菌利用還原糖進行增殖與發酵產生代謝產物，產生乙醇、乙酸乙酯等小曲中重要的呈香物質[35]。酒醅含水量與各種微生物的生化活動有密切的關系，含水量促進了窖池中微生物的生長、代謝和發酵，保證了還原糖的有效轉化。環境因素和微生物相互作用形成了清香型小曲原酒獨特風味。在小曲清香白酒新工藝條件下，不同時期的不同批次酒醅中的風味物質之間雖然有著波動變化，但之間沒有顯著差異，呈現出了與傳統工藝生產條件下不同的風味組成。這表明小曲白酒釀造新工藝在一定程度上擺脫了傳統工藝生產過多依賴于經驗的問題，通過機械智能對釀造環境因子和微生物群落進行調控，形成穩定釀酒生態微環境，有助于維持酒體風味物質穩定。

本研究對不同時期清香型小曲白酒新工藝酒醅發酵過程中的環境因素、微生物動態變化和風味物質變化規律進行探討，并利用多元統計分析方法探究了環境因素對酒醅微生物以及環境因素、酒醅微生物對酒醅風味物質的影響。分析結果顯示不同時期不同批次的酒醅環境因子、微生物動態變化和風味物質之間并沒有顯著的差異；且環境因子水分、還原糖和淀粉以及酵母總數是影響酒醅中風味物質的重要因素。這對于解析清香型小曲白酒發酵的機理以及通過調整生產參數提高固態發酵過程的可控性具有重要意義。