甘蔗渣在添加劑和輔助酶作用下的濃醪酶解糖化

KANEZA PASCAL，楊林青，孫付保*，肖志紅，劉汝寬，孫海彥

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)3(湖南省林業科學院生物能源研究所，湖南 長沙，410004)4(中國熱帶農業科學院 熱帶生物技術研究所，海南 海口，571101)

利用豐富的木質纖維素生物質可再生資源生產纖維素乙醇可有效緩解當前能源危機。然而，目前過高的生產成本嚴重阻礙了纖維素乙醇的商業化進程。WINGREN等[1]研究發現，當基質濃度每提高3%，相應的操作成本會降低 19%。而當基質濃度從 20%上升到 30%時，燃料乙醇的成本能降低 0.1美元/加侖。因此，高基質濃度(濃醪)酶解工藝相比于低基質濃度酶解工藝，其在經濟效益方面的優勢非常巨大。可見，纖維素生物質原料生產燃料乙醇的一個關鍵在與如何實現高基質濃度的酶解產糖。

針對此問題[2]，不少研究者圍繞糖化發酵工藝和改進辦法進行了不懈探索，如添加輔助酶及添加劑、分批補料和改變濃醪混合方式等。ZHANG等[3]在酶解實驗中分別添加150 mg/g干基BSA和Tween 80后，酶解24 h時葡萄糖產率較對照組(22.7%)分別提高至61.6%和62.2%。趙曉斌在10 FPU/g干基和20%基質濃度條件下以甲酸預處理甘蔗渣為底物進行批次酶解和分批補料實驗，酶解144 h后分批補料方式的葡萄糖產量比批次酶解提高15%。余恒以預處理后玉米秸稈為基質，采用圓底燒瓶和機械攪拌方式進行20%濃度的基質酶解，葡萄糖產量達到120.7 g/L，較搖床振蕩水解(葡萄糖產量96.4 g/L)提高25%。這些結果顯示，采用輔助水解策略，如添加劑、輔助酶、機械攪拌和分批補料等，有可能改善纖維基質濃醪水解黏度大和傳質傳熱困難等不足，實現木質纖維素基質在低酶載條件下的高效濃醪水解糖化。

基于此，本文以實驗室已有的堿催化常壓甘油有機溶劑預處理甘蔗渣為原料，嘗試開展低酶載量(6 FPU/g DM)下基質濃醪(350 g/L)水解糖化的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑材料與儀器設備

甘蔗渣(廣西壯族自治區)過篩，篩選尺寸5 mm×1 mm左右的甘蔗渣，烘干后存于塑封袋備用。使用前測定其3大主要組分含量：纖維素43.3%、半纖維素27.6%、木質素21.5%。工業甘油(純度99.5%)，購自無錫化工站；纖維素酶Cellic CTecⅡ濾紙酶活140 FPU/mL，來自諾維信(中國)生物技術有限公司；溶菌酶，來自國藥集團；木聚糖酶蛋白(含量158 mg/g)，來自青島蔚藍生物有限公司饋贈。高效液相色譜儀，日本HITACHI公司;SBA-40E 生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；HYG-A全溫搖瓶柜，江蘇太倉實驗設備廠。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗渣的堿催化常壓甘油有機溶劑預處理

準確稱量150 g篩選好的絕干甘蔗渣放入5 000 mL三口燒瓶中，隨后緩緩加入1 500 g工業甘油，接著添加4.45 g NaOH。將上述裝置放入恒溫加熱套中，設定預處理溫度257 ℃，待溫度上升至257 ℃后開始計時18 min。反應結束后，首先將1 500 mL自來水倒入燒瓶內使基質充分解離后用G1砂芯漏斗進行過濾，接著用2 000 mL自來水對上步濾餅先后洗滌2次并用G1砂芯漏斗進行過濾，最終所獲濾餅即為al-AGOP甘蔗渣基質。預處理后將基質自然晾至水分含量為50%，存于塑封袋并置于4 ℃層析柜備用。

1.2.2 酶解

(1)搖瓶振蕩酶解

在250 mL錐形瓶中準確加入9.5 g甘蔗渣基質，按5 FPU/g干基質添加纖維素酶，加入相應的添加劑和輔酶后添加50 mL檸檬酸緩沖液(pH 4.8)。將錐形瓶置于全溫搖瓶柜中進行酶解，條件設定為50 ℃，180 r/min，分別于6、12、24、36、48、60和72 h取樣并測定葡萄糖濃度。

(2)機械攪拌酶解

準確稱量相應質量甘蔗渣基質放入250 mL圓底燒瓶中，加入適量的pH 4.8檸檬酸緩沖液至總體積為45 mL，加入6 FPU/g干基纖維素酶和適量添加劑或輔酶，接著將帶有橡膠塞的雙葉攪拌槳放入圓底燒瓶中并與機械攪拌(轉速150 r/min)裝置固定于50 ℃恒溫水浴鍋中進行酶解。高濃酶解采取分批補料方式，在所需補料時間點暫停機械攪拌補入相應補料量后繼續進行機械攪拌酶解，并在6、12、24、36、48、60和72 h取樣并檢測樣品中的葡萄糖濃度。

1.3 分析測定方法

濾紙酶活(FPA)依照國際理論和應用化學協會(IUPAC)推薦的國際標準法測定[4]。通過高效液相色譜(HPLC)法(色譜柱BioRad Aminex HPX-87H,300 mm×7.8 mm)檢測組分含量中葡萄糖、木糖濃度，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫60 ℃，示差檢測器(日立HITACHI)。酶水解過程中葡萄糖濃度采用SBA-40E 生物傳感分析儀法確定。所有實驗均重復3次并取平均值且標準偏差小于2%。

2 結果與分析

2.1 添加劑的選擇

2.1.1 單因素實驗

相關文獻顯示[5-6]，添加劑可以通過疏水作用和氫鍵作用于木質素，阻止纖維素酶和木質素之間無效吸附，進而促進纖維素酶解進程。因此，本實驗考察了3種添加劑(牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)、Tween 20、茶皂素)對預處理后甘蔗渣的酶解影響。首先通過單因素實驗確定BSA、Tween 20、茶皂素相對較優的濃度，實驗結果如圖1所示。

圖1 單因素實驗優化添加劑濃度Fig.1 Single factor experiment of additive concentration

如圖1所示，隨著BSA添加量的增大，al-AGO預處理甘蔗渣酶解產葡萄糖濃度呈現先增長后降低的趨勢。當BSA質量濃度達到30 mg/g干基時，葡萄糖質量濃度達到最高為96 g/L，比對照組(80 g/L)提高了20%。因此，實驗選擇BSA添加量為30 mg/g干基。添加茶皂素時，葡萄糖濃度隨著茶皂素添加量也呈先增加后降低的趨勢。當茶皂素添加量為10 mg/g干基時，葡萄糖質量濃度達到最大為89.0 g/L，相較于空白組(78.0 g/L)提高了14%。因此，選擇10 mg/g干基茶皂素用于后續實驗。添加Tween 20時，葡萄糖質量濃度隨著Tween 20添加量的增加呈先上升后降低的趨勢。當Tween 20 添加量低于20 mg/g干基時，葡萄糖濃度均隨著Tween 20添加量的增大而增大；添加量為20 mg/g干基時葡萄糖質量濃度達到最高為89.0 g/L，較對照組(80 g/L)提高了約11%。因此，選擇添加量為20 mg/g干基Tween 20用于后續實驗。

2.1.2 正交實驗優化

經過上述對添加劑的單因素優化后，本實驗最終確定添加劑種類及質量濃度為：30 mg/g干基BSA、10 mg/g干基茶皂素、20 mg/g干基Tween 20。為了進一步考察各因素之間對酶解作用的相互影響，實驗接著使用軟件minitab針對BSA、茶皂素和Tween 20三個參數進行L9(34)正交試驗，實驗設計及結果如表1所示。

表1 糖化條件因素水平正交試驗分析Table 1 Orthogonal analysis of saccharification conditions

經過軟件分析，3個參數對基質酶解糖化影響大小的排秩順序為：茶皂素、Tween 20、BSA。最優組合為A2D2C3B1，即：10 mg/g干基茶皂素、25 mg/g干基Tween 20、10 mg/g干基BSA。結果表明，在此條件下酶解60 h時葡萄糖質量濃度達95.0 g/L。

2.2 輔助酶的選擇

2.2.1 溶菌酶最適濃度的確定

有文獻報道[7]，在纖維素酶解過程中添加適量溶菌酶可以減少木質素的無效吸附，進而促進酶解。因此，本實驗在酶解開始時添加10、20、30、40 mg/g干基的溶菌酶，考察溶菌酶添加量對酶解效果的影響。結果如圖2所示，添加不同濃度的溶菌酶，對酶解并沒有促進效果，各實驗組與對照組葡萄糖濃度基本持平，因此,本實驗不采用溶菌酶作為額外輔酶使用。

圖2 溶菌酶對酶解的影響Fig.2 The influence of lysozyme on hydrolysis

2.2.2 木聚糖酶最適濃度的確定

一些報道顯示[1,8]，預處理后木質纖維原料的細胞壁結構破碎，使得纖維素暴露于外部，但在細胞壁結構中仍存在部分半纖維素纏繞在纖維素外部，還有部分半纖維素可經纖維素孔延伸至原纖維絲中阻礙纖維素酶吸附纖維素。因此，本實驗在酶解初始時添加0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/g干基的內切木聚糖酶(endoxylanase,EX)，考察其對基質酶解的影響。結果如圖3所示，在EX存在下纖維素和半纖維素的酶解能力均有明顯提高。隨著EX添加量增大，酶解過程中葡萄糖和木糖濃度也隨之增大；但當添加量超過0.6 mg/g干基時增幅變緩，產糖量基本持平。因此，后續實驗按0.6 mg/g干基添加EX。在此條件下酶解60 h后葡萄糖質量濃度為97.4 g/L，相較于空白組(80.0 g/L)提高了21.8%；木糖質量濃度為39.1 g/L，相較于空白組(28.2 g/L)提高了38.7%。

圖3 木聚糖酶對酶解的影響Fig.3 The influence of xylanase on hydrolysis

2.3 濃醪酶解糖化

根據相關文獻報道[9-10]，當基質質量濃度大于150 g/L時，可認定為高基質濃度。但在實際生產中，基質質量濃度高于150 g/L時，酶水解液將變得非常黏稠，使其難以在搖瓶中搖勻和高效酶解。同時，高質量濃度基質水解液中自由水含量較低，影響微粒的潤滑特性，阻礙纖維素酶與甘蔗渣基質有效結合。因此，本實驗為了實現高濃基質的酶解糖化，采用機械攪拌和全濕基分批補料方式進行酶解以促進纖維素酶與甘蔗渣基質的有效結合。

2.3.1 初始基質濃度的選擇

本實驗在總基質質量濃度保持在350 g/L不變的情況下，考察不同初始基質濃度對批次酶解(酶載量6 FPU/g干基)產糖的影響。實驗結果如圖4所示，葡萄糖濃度隨著初始基質濃度的增大而提高，在基質質量濃度大于190 g/L時,葡萄糖濃度增幅變緩。在基質質量濃度為190 g/L時，葡萄糖濃度最高，達到 94.7 g/L。據相關文獻報道，在進行分批補料過程中若初始基質濃度偏低，則導致后期補料量過高，酶解過程中醪液黏度增大不利于糖化；若初始基質濃度偏高，醪液過于黏稠影響傳質，導致纖維素酶和基質難以有效接觸，基質無法徹底液化從而無法進行補料。因此，本實驗選擇190 g/L作為初始基質質量濃度。

圖4 初始基質濃度的選擇Fig.4 The selection of initial substrate concentration

2.3.2 補料方式的確定

根據一些資料報道[1,11]，在補料過程中若單次補料量過高(高于10%)，會短時間內造成醪液過于黏稠，對后期補料造成困難；若單次補料量過少，則需要補料多次，纖維素酶酶活不足以支撐整個補料過程。可見，整個補料過程受到補料次數和補料量兩者相互作用的影響。因此，本實驗在前期實驗基礎上，以190 g/L為初始基質濃度，設計5種不同的補料量、補料次數，初步選擇最適合本實驗的補料方式，具體設計方案及結果如表2所示。

表2 分批補料次數選擇Table 2 The selection of feeding time

注：2%、4%、8%表示單次補料量(W/W)。

如表2所示，第1、2種補料方式，無論是葡萄糖濃度還是酶解率均相差不大；第3種補料方式的葡萄糖產量和酶解率在酶解全程均顯著高于其他實驗組，說明補料次數偏少影響酶解效果，補料3次的方式最適宜；第4、5種補料方式均為補料5次，但是第5種補料方式的葡萄糖產量和酶解率相對較高，說明第5種補料量相對合理，首次補料量不宜過高。因此，實驗初步選擇第3種補料方式，即分別在12、20和22 h補料8%、4%和4%。

在確定了3次補料方式為最優補料次數后，實驗在此基礎上進一步考察不同時間點、補料量的3次補料模式，以期縮短補料時間。因此實驗考察在第7、10和13 h分別補料6%、5%和5%；第12、18和21 h分別補料8%、4%和4%；第13、17和20 h分別補料7%、5%和4%三種補料模式。實驗條件為：酶載量6 FPU/g干基，酶解起始添加0.6 mg/g干基EX、10 mg/g干基茶皂素、25 mg/g干基Tween 20、10 mg/g干基BSA，補料最終濃度35%。實驗結果如表3所示。

補料方式1,由于補料時間較為集中且最終補料在13 h結束，因此在12 h基質尚未液化無法檢測，但后期酶解液液化時間充足，在24 h時基質已液化可檢測，在48 h時葡萄糖質量濃度及酶解率分別為160.6 g/L和76.5%；補料方式2的初始補料時間相對較晚(推遲5 h)，因此在初始補料時體系中葡萄糖質量濃度較高(86.3 g/L)，較補料方式1(76.9 g/L)高出約12%，但是在48 h時葡萄糖質量濃度(147.8 g/L)和酶解率(70.4%)相對補料方式1實驗組較低，可能的原因是該補料方式補料時間偏后，導致纖維素酶酶活在后期削弱與基質的結合能力變差；補料方式3在10 h時初始基質已液化并檢測到葡萄糖質量濃度79.3 g/L，該實驗組48 h葡萄糖質量濃度及酶解率分別為141.3 g/L和67.3%，明顯低于補料方式1。因此，補料方式1不論是補料時間還是單次補料量相對是較好的。因此，實驗最終選定補料方式1，即在7、10和13 h分別補料6%、5%和5%。

表3 3種不同補料方式對酶解的影響Table 3 The influence of feeding method on hydrolysis

實驗確定濃醪酶解條件為：在纖維素酶酶載量6 FPU/g干基、初始基質質量濃度190 g/L條件下，于酶解初始時一次性添加0.6 mg/g干基EX、10 mg/g茶皂素、10 mg/g BSA和25 mg/g干基Tween 20，接著于7、10和13 h分別補料6%、5%和5%，至最終質量濃度為350 g/L。在此條件下，運行濃醪酶解糖工藝全程，最終結果如下：預酶解48 h時，葡萄糖質量濃度高達160.7 g/L，酶解率為76.5%；木糖質量濃度達到58.7 g/L，半纖維素水解率為57.8%。工藝運行全程糖濃度變化如圖5所示。

圖5 濃醪酶解全程糖濃度變化Fig.5 The change of glucose concentrations during the high concentration hydrolysis

DAVID等[12]在加酶量為 10.7 FPU/g纖維素的條件下，通過分批補料的方式使基質質量分數達到 25%，240 h的水解液中的葡萄糖質量濃度將近 140 g/L，本實驗相較其不僅提高了基質濃度，且酶解時間縮短了192 h。該結果與我們實驗室前期工作相比也取得了明顯進步：王亮[13]曾以自催化常壓甘油有機溶劑預處理麥草，基質在30 FPU/g干基條件下進行半同步濃醪發酵(基質質量濃度350 g/L)，24 h時葡萄糖質量濃度為58.2 g/L；本實驗酶載量僅為6 FPU/g，24 h葡萄糖質量濃度達到123.8 g/L，約為其2倍。洪嘉鵬[14]以堿催化常壓甘油有機溶劑預處理后甘蔗渣為基質，在6 FPU/g干基條件下進行半同步濃醪發酵(基質質量濃度350 g/L)，預酶解72 h,葡萄糖質量濃度為132 g/L，本實驗相比其不僅酶解時間縮短了24 h，且葡萄糖質量濃度提高了約22%。可見，本文確定的輔助酶和添加劑的種類、濃度和分批補料模式可顯著提高高基質濃度體系的酶解產糖量，為后續實現高濃度纖維素乙醇發酵提供可能。

3 結論

堿催化常壓甘油有機溶劑預處理甘蔗渣在6 FPU/g干基酶載量條件下,通過分批補料方式(初始基質質量濃度190 g/L)達到濃醪(350 g/L)酶解，使用添加劑(10 mg/g茶皂素、10 mg/g BSA、25 mg/g Tween 20)和木聚糖酶(0.6 mg/g干基)酶解48 h,可發酵性糖高達220 g/L，其中葡萄糖和木糖產量分別為160.7和58.7 g/L，具有明顯的工業意義。分批補料方式是實現木質纖維素基質濃醪水解糖化的有效途徑，添加劑和輔助酶不但有助于底物的常規酶解糖化，在濃醪基質糖化過程中仍具有積極作用。