基于TT51-1水稻種子標準曲線檢測的可靠性分析

袁建琴 孔艷彪 李麗

摘 要：為了分析在同一個實驗室的2臺不同型號的實時熒光定量PCR儀（擴增曲線和標準曲線的相關參數）可比性，在常規條件下，使用同一批號的試劑，將標準品及同一水稻種子樣品TT51-1在2臺熒光定量PCR儀上進行擴增，對標準曲線的參數及分析結果進行比對，分析其一致性。結果表明，作為單一的檢測系統，運用同一批號試劑對相同標準品及待檢樣品的試驗中，2臺實時熒光定量PCR儀測定的結果差異沒有統計學意義（P > 0.05）。通過對標準曲線的相關參數和待檢測樣品的檢測結果的分析，可以判定實驗室存在的2臺實時熒光定量PCR儀檢測的結果的一致性，可確保檢測結果可靠。

關鍵詞：TT51-1水稻;標準曲線;轉基因成分檢測;實時熒光定量PCR;可靠性分析

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190830004

基金項目：山西省高等學校教學改革創新項目“開放式生物技術專業實踐教學體系的研究與實踐”（項目編號：J2018079）;山西農業大學科技創新基金資助“基于DNA甲基化探究雙酚A致Marc-145細胞毒性機制”（項目編號：2016ZZ09）; 山西省科技攻關項目“主要轉基因深加工農產品定量檢測技術研究”（項目編號：20140311025-3）

實時熒光定量PCR技術在諸多領域都得到了廣泛應用，其領域涉及動物學、植物學、環境生物學和醫藥衛生等[1-3]。由于實時熒光定量PCR技術只要設計出能夠對應檢測樣品的引物與探針，就能夠實現特異性地結合的特點，也被廣泛地運用在對環境中的微生物變化進行檢測的方面[4-8]。雖然實時熒光定量技術擁有很強的特異性，很好的重復性，較高的自動化程度以及較快的檢測速度，但是影響實時熒光定量PCR技術的因素仍舊不能忽視。樣品的處理、試劑的選擇與儲存、核酸的提取、儀器的擴增、操作的規范性以及對于結果的分析都是可能影響到試驗的最終結果的因素[9-12]。對于實驗過程之中可能對于實驗結果造成影響的因素進行分析，對應尋找合適的解決措施與方法，可以提高檢驗檢疫的精確度。特別是隨著分子生物學的發展和分子生物學研究手段在檢測領域的運用，同一實驗室內有多臺實時熒光定量PCR儀的情況變得越來越常見。判斷2臺實時熒光定量PCR儀擴增與檢測結果的一致性，是實現實驗室的規范標準化亟待解決的問題。為此，本試驗在同一條件下，將100% TT51-1水稻標準物質和待測樣品（1% TT51-1水稻標準物質）在2臺實時熒光定量PCR儀上由同一操作人員使用相同試劑進行擴增，對標準曲線的相關參數和檢測結果進行分析，以此記錄和比照不同儀器的檢測結果是否具有的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水稻材料

1% TT51-1水稻標準物質作為待測樣品、100% TT51-1水稻標準物質作為陽性標準品（均由農業農村部科技發展中心提供）。

1.1.2 主要試劑

植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（DP130227，TIANFGEN（BEIJING） CO.LTD）、無水乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、β-巰基乙醇、適用于實時熒光定量的TaqDNA聚合酶以及緩沖液、dNTP等實驗室常規分析純試劑。

1.1.3 主要儀器

試驗中所用2臺實時熒光定量PCR儀，見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及純化

本試驗參照植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書進行提取基因組DNA。

1.2.2 DNA溶液的濃度和純度

開啟核酸蛋白定量檢測儀，用10μL移液器將2μL TE加入到測量孔中進行調零。

將2μL提純的DNA溶液加到測量孔，檢測DNA濃度，記錄結果，清洗測量杯，重復檢測DNA濃度3次并計算平均值。

1.2.3 樣品制備

初始模版的制備：將提取好并檢測濃度后的 DNA 溶液用滅菌的超純水稀釋至50ng/μL來作為初始的模板。

濃度梯度溶液的制備：用滅菌的超純水對初始模板進行梯度稀釋，分別為10ng/μL、2ng/μL、0.4ng/μL、0.08ng/μL。

1.3 實時熒光定量PCR檢測

對樣品進行實時熒光定量PCR，檢測對象為水稻轉化體TT51-1和PLD基因。陽性標準品為100%的水稻標準物質，陰性對照為鮭魚精子DNA，空白對照是滅菌的ddH2O。檢測方法和引物探針參照農業部2122號公告-8-2014[13]。

1.3.1 實時熒光定量 PCR 所用的引物與探針

實時熒光定量 PCR 所用的引物和探針見表2。

1.3.2 實時熒光定量PCR反應體系

試驗中TT51-1熒光定量PCR體系見表3，PLD熒光定量PCR體系見表4。

1.3.3 實時熒光定量PCR循環參數

實時熒光定量PCR體系見表5[14-16]。

2 結果與分析

2.1 樣品DNA含量檢測結果

100% TT51-1水稻標準物質的基因組DNA濃度和純度檢測結果，見表6。

提取100% TT51-1水稻標準物質的基因組DNA的濃度為538.5ng/μL，在25ng/μL以上，OD260/OD280為1.86，在1.7～2.0之間;OD260/OD230為2.04，大于2，說明所提取的DNA濃度與純度均符合實時熒光定量PCR的要求。

2.2 實時熒光定量PCR對于樣品的檢測結果（機型Ⅰ）

2.2.1TT51-1實時熒光定量PCR檢測標準曲線

100%TT51-1水稻標準物質DNA在機型Ⅰ上的標準曲線如圖1所示。

從圖1可以看出，TT51-1擴增效率為103.3%，R2為0.994>0.98，標準曲線斜率為-3.244≥-3.6，并且≤-3.1，能夠對樣品進行準確判定。

2.2.2TT51-1實時熒光定量 PCR 檢測的擴增曲線

圖2中，陰性對照和空白對照均無典型擴增曲線，待測樣品、陽性標準物質TT51-1均有典型擴增曲線。

2.2.3PLD基因實時熒光定量PCR檢測的標準曲線

PLD在機型Ⅰ上的標準曲線如圖3所示。

從圖3可以看出，PLD擴增效率為102.2%，R2為0.996>0.98，標準曲線斜率為-3.270≥-3.6，并且≤-3.1，能夠對樣品進行準確判定。

2.2.4 PLD實時熒光定量PCR檢測的擴增曲線

PLD在機型Ⅰ上的擴增曲線如圖4。

在圖 4 中，陰性對照和空白對照均無典型擴增曲線，樣品、陽性對照有典型擴增曲線。

2.2.5 Ct值和拷貝數

TT51-1和PLD基因的Ct值和拷貝數見表7。

2.2.6 樣品中轉化體含量的計算

樣品中TT51-1轉化體的含量可通過公式：C轉基因含量（%）=nTT51/nPLD*100%。計算結果見表8。

從表中可以得知，所檢樣品中含有TT51-1的轉化體含量為1.04%。

2.3 實時熒光定量PCR對樣品的檢測結果（機型Ⅱ）

2.3.1 TT51-1實時熒光定量PCR檢測的標準曲線

TT51-1在機型Ⅱ上的標準曲線如圖5所示。

從圖5可以看出，TT51-1擴增效率為104.8%，R2為0.988>0.98，標準曲線斜率為-3.211≥-3.6，并且≤-3.1，陰性對照與空白對照均沒有典型的擴增曲線，能夠對樣品數據進行準確判定。

2.3.2 TT51-1實時熒光定量 PCR 檢測的擴增曲線

TT51-1在機型Ⅱ上的擴增曲線如圖6所示。

在圖6中，陰性對照和空白對照均無典型擴增曲線，待測水稻樣品和陽性對照都有典型擴增曲線。

2.3.3 PLD實時熒光定量PCR檢測的標準曲線

PLD基因在機型Ⅱ上的標準曲線如圖7。

從圖7可以看出，PLD擴增效率為103.8%，R2為0.985>0.98，標準曲線斜率為-3.233≥ -3.6，并且≤-3.1，能夠對樣品數據進行準確判定。

2.3.4 PLD實時熒光定量PCR檢測的擴增曲線

PLD在機型Ⅱ上的擴增曲線如圖8所示。

在圖8中，陰性對照和空白對照均無典型擴增曲線，待測樣品和陽性對照均有典型擴增曲線。

2.3.5 Ct值和拷貝數

TT51-1及PLD基因的Ct值和拷貝數見表9。

2.3.6 樣品中轉化體含量計算

轉化體含量的計算結果見表10。

從表中可以得知，樣品中含有TT51-1的轉化體含量為0.97%。

3 討論

3.1 水稻基因組DNA的提取

由于原有的試劑盒法雖然提取步驟相對簡單，操作時間較短，但是提取效率低，試驗用改良試劑盒法提取水稻基因組DNA。改良試劑盒法增加苯酚、氯仿和異戊醇的抽提步驟，使提取的DNA濃度，與說明書理論值相比，提升400%。通過OD260/OD280和OD260/OD230可以判斷抽提的核酸的純度是否符合試驗的要求。試驗中所提取樣液的OD260/OD280在1.7～1.9之間，純度較好，濃度遠高于25 μL;OD260/OD230大于2.0，說明改良試劑盒法提取的DNA可以作為后續試驗熒光定量PCR的模板。

3.2 標準曲線與擴增曲線的分析

圖1、圖3是在機型Ⅰ上水稻轉化體TT51-1和PLD基因的標準曲線，圖5、圖7是在機型Ⅱ上TT51-1和PLD的標準曲線，由農業農村部科技發展中心提供的100% TT51-1標準物質作為陽性標準品。在標準曲線的參數中，相關系數需滿足大于0.98，擴增效率需滿足大于90%，小于110%。圖1、圖3、圖5、圖7的相關系數與擴增效率均滿足需求，可以用來計算待測樣品的最初拷貝數。圖2、圖4是在機型Ⅰ上TT51-1和PLD的擴增曲線，圖6、圖8是在機型Ⅱ上TT51-1和PLD的擴增曲線。可以看出，曲線的拐點都比較明顯，整體的平行性好。曲線在指數期的斜率較大，這表明PCR擴增效率比較高。圖中的待測樣品擴增曲線在第25個循環后進入指數期，說明樣品的起始拷貝數比較低。

3.3 2種機型擴增結果的比較

3.3.1 基于系統擴增曲線和標準曲線的分析

利用100% TT51-1水稻標準物質在2臺PCR儀上檢測1%水稻標準物質的TT51-1擴增結果，如圖2和圖6所示。圖中，基因組DNA濃度為50ng/μL、10ng/μL、2ng/μL、0.4ng/μL、0.08ng/μL的Ct值在機型Ⅰ和機型Ⅱ上的平均平均值分別為26.89、30.17、32.92、35.01、36.67和27.06、30.62、32.65、35.40、36.94，2臺儀器的曲線都呈現標準的“S”型擴增，曲線之間的間距均一;從標準曲線圖上可以看出，2臺不同儀器繪制的標準曲線斜率分別為-3.244、-3.211，都和理論斜率值接近，相關系數也都大于0.98，因此，這次擴增有效，并且擴增效率比較高。100% TT51-1水稻標準物質在2臺PCR儀的擴增結果（PLD）如圖4和圖8所示。圖中，基因組DNA濃度為50ng/μL、10ng/μL、2ng/μL、0.4ng/μL、0.08ng/μL的Ct值在機型Ⅰ和機型Ⅱ上的平均值分別為29.79、32.43、34.40、36.66、38.63和27.03、30.49、32.88、34.90、36.55，2臺儀器的曲線也都呈現標準的“S”型擴增，曲線之間的間距均一;從標準曲線圖上可以看出，2臺不同儀器繪制的標準曲線斜率分別為-3.270、-3.233，都和理論斜率值接近，相關系數也都大于0.98，因此，這次擴增有效，并且擴增效率比較高。選擇這樣的濃度梯度，滿足點分布均勻和具備定量極限處數值，繪制的曲線更具有代表性。

3.3.2 對于樣品檢測結果的分析

2臺儀器均檢出1%水稻中的TT51-1轉化體含量，在機型Ⅰ中為1.04%，機型Ⅱ中為0.97%（真實值為1%），說明機型Ⅰ和機型Ⅱ檢測結果與實際值無顯著差異（P>0.05）。

4 結論

本試驗利用100% TT51-1轉化體標準物質和待測水稻種子粉末（1% TT51-1轉化體標準物質）對實驗室2臺不同型號實時熒光定量PCR儀進行結果比對，表明2臺實時熒光定量PCR儀檢測結果無顯著差異，均可滿足科研及檢測需要。

參考文獻

[1] Clive James.國際農業生物技術應用服務組織. 2016年全球生物技術/轉基因作物商業化發展態勢[J]. 中國生物工程雜志， 2017， 37（04）： 1-8.

[2] 徐婷婷. 熒光定量PCR技術應用綜述[J]. 畜禽業， 2010（10）： 48-50.

[3] 朱捷， 楊成君， 王軍. 熒光定量PCR技術及其在科研中的應用[J]. 生物技術通報， 2009（2）： 73-76.

[4] 楊弘華， 宋燕燕， 林曉波， 等. 實時熒光定量PCR技術應用研究[J]. 山東化工， 2016， 45（22）： 46-47.

[5] 黃東東， 翁少萍， 呂玲，等. Taq Man MGB 實時熒光PCR對轉基因大豆定量檢測的研究[J]. 中山大學報， 2008， 47（03）： 140-142.

[6] 李富威， 張舒亞， 葉軍， 等. 食品中木瓜成分實時熒光PCR檢測方法[J]. 食品研究與開發， 2013， 34（11）： 51-56.

[7] 李婭， 韋平， 金元昌， 等. 實時熒光PCR檢測雞GAPDH基因方法的建立[J]. 中國家禽， 2008， 30（08）： 37-40.

[8] 拜廷陽， 楊增岐， 吳志明， 等. 豬鏈球菌 9 型熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[J]. 西北農林科技大學學報， 2008（1）： 7-12.

[9] 趙曉祥， 龐曉倩， 莊惠生. 熒光定量PCR技術在環境監測中的應用研究[J]. 環境科學與技術， 2009， 32（12）： 125-128.

[10] 何閃英， 于志剛. 紅色裸甲藻實時定量PCR快速檢測方法的建立[J]. 浙江大學學報：農業與科學生命版塊， 2009， 35（02）： 119-126.

[11] 劉洪波， 劉曉雷， 羅小銘. 核酸提取方法進展[J]. 現代生物醫學進展， 2011， 11（16）： 3187-3190.

[12] 楊怡姝， 孫曉娜， 王小利， 等. 實時熒光定量PCR技術的操作實踐[J]. 實驗室研究與探索， 2011， 30（07）： 15-19.

[13] 中華人民共和國農業部. 農業部2122號公告-8-2014： 轉基因植物及其產品成分檢測 抗蟲水稻TT51-1及其衍生品種定量PCR[S]. 北京： 中國農業出版社， 2014.

[14] 袁建琴， 常泓， 趙江河， 等. 轉基因大豆豆粕外源基因和蛋白在SD大鼠體內消化吸收分析[J]. 生物工程學報， 2016， 32（05）： 657-668.

[15] 袁建琴， 趙江河， 史宗勇， 等. 動物飼料中轉基因抗草甘膦大豆GTS40-3-2成分的檢測[J]. 大豆科學， 2016， 35（02）：295-300.

[16] 袁建琴， 常泓， 趙江河， 等. 山西市場動物飼料中轉基因成分的檢測（英文版）[J]. 生物工程學報， 2016， 32（11）： 1576-1589.