牛乳αS1-酪蛋白與大豆蛋白交叉過敏原的識別鑒定

叢艷君，呂曉哲，李 曄，劉 迪，李鄰峰

（1.北京工商大學食品與健康學院，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，

食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.北京友誼醫院皮膚科，北京 100050）

世界糧農組織1995年報告，90%以上的食物過敏是由牛奶、雞蛋、魚、甲殼類動物、花生、大豆、堅果類和小麥引起。一些過敏患者對某種食物過敏，然后食用其他同源食物或非同源食物也可能產生過敏反應，這種現象稱為食物的交叉過敏，但是與同源食物發生過敏的頻率及強度顯著高于非同源食物，比如牛乳與其他動物乳類、蝦和貝殼海產品，花生和其他豆類食物等[1-3]。食物交叉過敏的普遍性和復雜性增加了食物過敏發生的概率，同時增加了建立精準高效的過敏原定量檢測方法及開發低過敏食品的難度。過敏原的交叉反應研究一直是食品過敏學領域的重要研究課題，識別鑒定交叉過敏原，分析其結構與致敏特性的關系，對于過敏原檢測、診斷以及過敏原脫敏疫苗設計，指導過敏患者合理飲食，開發新型低過敏食品，合理有效避免交叉過敏反應發生均具有重要的意義。

每100 mL牛乳約含有3 g蛋白質，包含至少25 種不同的蛋白質，是嬰幼兒最理想的母乳替代品，但是牛乳中這些蛋白質都可能是潛在的過敏原[4]，研究表明，酪蛋白中的4 種組分是主要過敏原，并且αS1-酪蛋白的致敏性要強于αS2-、β-、κ-酪蛋白[5-6]。大豆蛋白質的氨基酸組成平衡合理，可以提供嬰幼兒正常的生長和免疫需求，并且成本低，適口性好，因此大豆蛋白質也被廣泛應用于嬰幼兒食品中。通常將大豆種子中的過敏原蛋白可分為5 大類，Gly m 5（β-伴大豆球蛋白）、Gly m Bd 30K/P34、Gly m Bd 28K/P28、Gly m 6（大豆球蛋白）和Gly m Ti（胰蛋白酶抑制劑）[7]。本課題組前期系統研究了牛乳主要過敏原αS1-酪蛋白的作用表位及關鍵氨基酸[8]，而牛乳αS1-酪蛋白與大豆蛋白中的致敏蛋白是否存在交叉過敏反應是本研究的重點內容。

本研究以牛乳過敏嬰幼兒血清、αS1-酪蛋白單克隆抗體為探針，通過免疫印跡實驗識別鑒定大豆蛋白質交叉過敏原，并通過生物信息學軟件進行序列比對，驗證體外實驗結果，最后深入探究了交叉過敏原的消化穩定性和熱穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

αS1-酪蛋白 美國Sigma公司；αS1-酪蛋白單克隆抗體 實驗室自制；低分子質量標準蛋白 北京天根生物科技有限公司；HRP-鼠抗人IgE、HRP-羊抗小鼠IgG北京友誼中聯生物技術有限公司；大豆分離蛋白 上海源葉生物科技有限公司；96 孔酶標板 北京拜爾迪生物技術有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜 美國密理博公司。

1.2 儀器與設備

KHB ST-360酶標儀 上海科華實驗系統有限公司；DYY-7C型電泳儀、電熱恒溫水浴鍋 北京市六一儀器廠；SH-2磁力攪拌器 北京東方開物科學器材公司；BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳過敏患者血清的收集

篩選8 名牛乳過敏患者（年齡在2～3 歲），4 男4 女，臨床癥狀均為特異性皮炎，收集血清，血清IgE抗體含量為25～100 kU/L。5 名非牛乳過敏兒童（5～10 歲）血清作為陰性對照。陽性、陰性血清均等體積混合用以識別交叉過敏原。

1.3.2 牛乳αS1-酪蛋白單克隆抗體的制備、亞型鑒定及效價測定

牛乳αS1-酪蛋白單克隆抗體的制備按照Docena等[9]的方法，亞型鑒定采用IgG酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒測定，間接ELISA法測定單抗效價[10]，以5 μg/mL的αS1-酪蛋白（溶解液為50 mmol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液）作為包被抗原，抗體按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000倍數稀釋（稀釋液為磷酸鹽緩沖溶液），底物顯色液為60 mg四甲基聯苯胺溶于10 mL二甲基亞砜配制而成。以未被免疫的正常小鼠血清為陰性對照，測定450 nm波長處的OD值。

1.3.3 牛乳αS1-酪蛋白與大豆蛋白交叉反應原的鑒定

分別以牛乳過敏患者血清、αS1-酪蛋白單抗為探針，用免疫印跡法識別大豆蛋白交叉過敏原。首先用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離αS1-酪蛋白、α-酪蛋白、大豆分離蛋白、牛乳蛋白，然后將分離膠上的蛋白轉印到PVDF膜上，進而在膜上完成免疫印跡反應，一抗為牛乳過敏患者混合血清（稀釋倍數1∶10）或αS1-酪蛋白抗體（稀釋倍數1∶16 000），二抗為HRP-鼠抗人IgE（稀釋倍數1∶2 000）或HRP-羊抗小鼠IgG（稀釋倍數1∶4 000），以4-氯-1-萘酚為底物顯色液[11-13]。陰性血清作對照。

1.3.4 牛乳αS1-酪蛋白與大豆Gly m Bd 60K的氨基酸序列比對

通過GenBank檢索αS1-酪蛋白與Gly m Bd 60K的基因序列，應用DNAStar軟件導出各蛋白的氨基酸序列，利用NCBI網頁工具中的BLASTp工具比對相似氨基酸序列[14-17]。

1.3.5 交叉過敏原在模擬胃液中的消化穩定性

胃蛋白酶活力的測定采用GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》[18]中的福林-酚法。消化穩定性實驗參照國家標準農業部869號公告-2-2007《模擬胃腸液外源蛋白質消化穩定性試驗方法》[19]進行。以國際公認的過敏原雞蛋清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑為陽性對照，無致敏性的馬鈴薯酸性磷酸酶為陰性對照。將模擬胃液消化處理的樣品進行SDS-PAGE。

1.3.6 加熱對過敏原交叉反應特性的影響

以不同加熱時間和加熱溫度對分離提取的大豆蛋白Gly m Bd 60K進行加熱處理，分別于70、100 ℃對Gly m Bd 60K加熱10、20、30、40、50、60 min。通過免疫印跡實驗以αS1-酪蛋白單抗為探針評價加熱對過敏原交叉反應性的影響。

1.4 數據分析

采用微軟Excel 2010軟件進行圖表制作，采用SPSS 17.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 牛乳過敏患者血清識別交叉過敏原

圖1 牛乳過敏患者血清識別大豆蛋白交叉過敏原Fig. 1 Identification of cross-reactive allergens with cow milk allergic patients' sera

如圖1A所示，第3泳道大豆蛋白條帶由上到下分別為α’亞基、α亞基、β亞基、A3、11S酸性鏈、38 kDa、11S堿性鏈、14.4 kDa蛋白，第4泳道牛乳蛋白條帶由上到下分別為乳鐵蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。圖1B為牛乳過敏患者混合血清識別4 種蛋白的結果，牛乳過敏患者混合血清與αS1-酪蛋白發生了特異性反應，說明患者血清中含有αS1-酪蛋白特異性IgE。牛乳過敏患者混合血清與大豆中的β-伴大豆球蛋白α亞基（Gly m Bd 60K）和11S堿性鏈發生了免疫反應。為排除假陽性反應，用小鼠陰性血清進行了免疫印跡實驗，如圖1C所示，陰性小鼠血清與αS1-酪蛋白、α-酪蛋白沒有發生反應，與大豆分離蛋白反應了一個條帶，分子質量為21 kDa的11S堿性鏈，說明11S堿性鏈為非特異性吸附。即牛乳過敏患者血清識別大豆蛋白的交叉過敏原為β-伴大豆球蛋白α亞基（Gly m Bd 60K）。

2.2 牛乳αS1-酪蛋白單克隆抗體識別交叉過敏原

經鑒定αS1-酪蛋白單克隆抗體的亞型為IgG1，效價為1∶320 000。將凝膠上的蛋白條帶成功轉印到PVDF膜上后，然后通過免疫印跡實驗鑒定抗體與大豆蛋白的交叉反應特性，結果見圖2A，αS1-酪蛋白、α-酪蛋白、大豆分離蛋白與αS1-酪蛋白抗體均發生了免疫反應，與大豆分離蛋白反應結果顯示出2 個條帶，測定其分子質量分別為68、21 kDa，即為β-伴大豆球蛋白α亞基（Gly m Bd 60K）和11S堿性鏈。為排除假陽性反應，用小鼠陰性血清進行了免疫印跡抑制實驗，如圖2B所示，小鼠陰性血清與αS1-酪蛋白、α-酪蛋白沒有發生反應，與大豆分離蛋白反應了1 個條帶，分子質量為21 kDa，即為大豆11S堿性鏈。因此大豆β-伴大豆球蛋白α亞基與αS1-酪蛋白抗體發生了特異性免疫反應，為交叉過敏原。

圖2 αS1-酪蛋白單克隆抗體識別大豆分離蛋白的免疫印跡圖Fig. 2 Immunoblotting of soybean protein isolate identi fi ed by αS1-casein monoclonal antibodies

2.3 牛乳αS1-酪蛋白與大豆Gly m Bd 60K的氨基酸序列比對

αS1-酪蛋白在GenBank的登錄號為AAA30429.1，Gly m Bd 60K的登錄號為BAA23360.2，應用DNAStar軟件導出各蛋白的氨基酸序列。用BLASTp工具分析兩種蛋白質的序列相似性為39%，兩種蛋白的相似氨基酸序列如表1所示。

表1 αS1-酪蛋白與Gly m Bd 60K的相似氨基酸序列Table 1 Similar amino acid sequences between αS1-casein and Gly m Bd 60K

2.4 交叉過敏原的消化穩定性

圖3 過敏原在體外模擬胃液中消化性后的SDS-PAGE圖Fig. 3 SDS-PAGE profile of allergens digested in simulated gastric fluid

本實驗以雞蛋清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑為陽性對照，以馬鈴薯酸性磷酸酶為陰性對照，通過比較這5 種蛋白在體外模擬胃消化系統中的穩定性，探究交叉過敏原Gly m Bd 60K（β-伴大豆球蛋白的α亞基）的穩定性。如圖3所示，大豆胰蛋白酶抑制劑到60 min仍未被胃蛋白酶消化，推測其具有很強的抗消化性；雞蛋清白蛋白在30 min時條帶完全消化；αS1-酪蛋白在2 min時條帶完全消化；馬鈴薯酸性磷酸酶經過胃蛋白酶消化15 s時條帶消失。交叉過敏原Gly m Bd 60K在15 s條帶顏色雖然變淺，但仍清晰可見，2 min時條帶消失，推測Gly m Bd 60K在模擬胃液中的消化時間為2 min。根據SDS-PAGE結果，消化穩定性由強到弱為大豆胰蛋白酶抑制劑＞雞蛋清白蛋白＞αS1-酪蛋白= Gly m Bd 60K＞馬鈴薯酸性磷酸酶，大豆交叉過敏原Gly m Bd 60K的消化穩定性比較好。

2.5 加熱對過敏原交叉反應性的影響

圖4 70、100 ℃加熱Gly m Bd 60K免疫印跡鑒定圖Fig. 4 Immunoblotting pattern of Gly m Bd 60K heated at 70 or 100 ℃

從圖4可以看出，在70、100 ℃加熱不同時間，Gly m Bd 60K與αS1-酪蛋白單克隆抗體發生了特異性免疫反應，陰性血清結果有效排除了假陽性反應，即加熱沒有影響Gly m Bd 60K與αS1-酪蛋白抗體的交叉反應性。

3 討 論

食物交叉過敏一般發生在同源性比較高或者是具有相似線性表位或構象表位的過敏蛋白之間，有研究表明構象表位在交叉過敏反應中貢獻不大[20]。目前公認的預測交叉過敏反應標準為：在超過80 個氨基酸殘基的過敏蛋白質中，其序列的同源性大于30%或者具有6 個連續相似的氨基酸序列，則認為有可能產生交叉過敏反應[21]，但是預測的結果往往會出現假陽性，如果同源性大于35%，假陽性減少4%[22]。因此，過敏原之間序列的同源性的比較只作為一種預測交叉過敏的方法，體外實驗檢測以及臨床的診斷才是確認過敏原是否存在交叉過敏的有效方法。本研究通過生物信息學工具和軟件預測αS1-酪蛋白和Gly m Bd 60K蛋白序列相似性為39%，并找到兩組相似氨基酸序列，兩種蛋白可能會發生交叉過敏反應。

牛乳過敏發生率呈上升趨勢，3 歲以內兒童牛乳過敏發生率超過8%[23]，由于乳蛋白之間的抗原表位存在顯著的同源性，目前已有研究表明，許多其他哺乳動物乳蛋白與牛乳蛋白存在較強的交叉反應。例如，在Restani等[24]的研究中，牛乳過敏患者血清的IgE能夠識別水牛和羊的乳品蛋白，交叉過敏原主要是α-酪蛋白和β-乳球蛋白，而且在抗體血清IgE識別中，50%的羊乳與牛乳具有相同的親和力，而抗體血清對駱駝乳或人乳的蛋白質沒有免疫反應。大約50%的牛乳過敏患者對αS1-酪蛋白過敏[25]。根據國際免疫聯合會對過敏原的統一命名，αS1-酪蛋白命名為Bos d 9，分子質量為25.2 kDa，為1 條單鏈的磷酸化蛋白質，由199 個氨基酸構成，脯氨酸含量較高，包括大約70%的無規則結構和小部分的二級結構，二級結構主要是α-螺旋和β-折疊，沒有二硫鍵，三級結構比較簡單[26]。對于牛乳過敏癥的治療方法主要是避免飲食中的牛乳蛋白質，為此對于牛乳過敏嬰幼兒，基于大豆蛋白的配方粉是最理想的替代品。大豆基嬰幼兒配方粉在全球的使用已有100 a左右，在美國、加拿大、中國等國占有一定的嬰幼兒配方食品市場。然而，一些牛乳過敏嬰幼兒也對大豆蛋白過敏[27]。因此開展牛乳蛋白與大豆蛋白交叉過敏原的研究具有重要的現實意義。

近幾年國內外開始探究牛乳與大豆蛋白的交叉過敏原。Curciarello等[28]研究發現牛乳酪蛋白與大豆蛋白的交叉過敏原為Gly m 5，識別的IgE和IgG作用表位存在于α亞基，并且包括構象表位。進而，還發現大豆P34與牛乳酪蛋白也具有序列相似的作用表位[29]。Candreva等[30]用牛乳過敏患者血清識別到大豆交叉過敏原蛋白Gly m Bd 28K，其能夠引起人外周血嗜堿性粒細胞脫顆粒，誘發免疫小鼠IL-13分泌。Candreva等[31]通過酶解的方法獲得αS1-酪蛋白和Gly m 5的多肽，發現識別的αS1-酪蛋白的4 個作用表位與Gly m 5的3 個作用表位存在共同的序列區域。在此基礎上，本研究以中國牛乳過敏嬰幼兒血清為探針，通過免疫印跡方法識別鑒定大豆蛋白的交叉過敏原為β-伴大豆球蛋白α亞基，即Gly m Bd 60K蛋白，體外模擬胃液消化實驗表明α亞基具有較強的抗消化性，熱處理不會影響牛乳αS1-酪蛋白單克隆抗體與α亞基的免疫反應特性。

臨床對過敏患者治療時，要充分考慮食物之間的交叉反應性，既要找到可能造成高過敏風險的食物，還要避免不必要的食物限制。事實上，對于一些食物，即使體外檢測呈陽性的交叉敏感性，但真正的交叉反應性識別并沒發生，在研究中對這兩個名詞存在一些混淆，交叉反應性是用于定義真正的臨床反應[32]。例如，腰果過敏患者對開心果具有交叉敏感性，大多數花生過敏患者可能對其他豆類會呈陽性反應，但可以毫無影響地食用。體內實驗是驗證食物過敏原具有交叉反應特性的最有效手段，這也是未來交叉過敏原研究的重點內容。目前，對于導致不同食物間交叉過敏的免疫病理學的詳細機制尚不完全清楚，由于過敏原之間的交叉過敏受到越來越多的關注，對交叉過敏反應的機理研究也成為當務之急。