正交試驗(yàn)法優(yōu)選復(fù)方金釵石斛保健酒滲漉工藝

李薪宇，牛曼思，楊 陽，童鈺琴，，楊雪琴，王松濤，稅丕先*

（1.西南醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州 646000）

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl.）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，俗稱金釵石、扁金釵、扁黃草、扁草或者黃草，因其形似古代婦女頭上的飾物金釵而得名[1]。金釵石斛是歷版《中國藥典》所記載的名貴中藥材，其具有滋陰清熱、生津益胃、清肝明目和潤肺止咳等功效[2]。金釵石斛中含有豐富的有效成分，主要有生物堿、多糖、黃酮、酚、倍半萜類化合物[3]，其中生物堿類成分石斛堿與多糖是主要發(fā)揮藥理活性的基礎(chǔ)物質(zhì)[4-10]。除此之外，還含有香豆素、甾體、吡喃酮、對(duì)羥基苯甲酸、β-谷甾醇、大黃酚類化學(xué)成分[11]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明金釵石斛具有保肝、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、降血糖血脂、緩解體力疲勞、延緩衰老等顯著功效[12]，目前已經(jīng)成為國內(nèi)外保健食品、醫(yī)療藥物等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

復(fù)方金釵石斛保健酒以金釵石斛、人參、黃芪、五味子、茯苓為原料，本方中大部分藥材使用部位為根莖，藥材質(zhì)地堅(jiān)韌，細(xì)胞壁多糖含量高，在長時(shí)間煎煮下，累積溶出率較低，因此非加熱的提取方式能增加有效成分的溶出[13]。目前運(yùn)用于生產(chǎn)上的非加熱提取方式工藝主要有靜態(tài)提取和動(dòng)態(tài)提取，動(dòng)態(tài)提取以滲漉法為代表，靜態(tài)提取以冷浸法為代表。滲漉提取可連續(xù)操作，藥材細(xì)胞內(nèi)外可持續(xù)維持較高濃度差，浸出效率高，是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，相當(dāng)于無數(shù)次浸漬，具有有效成分浸出完全、溶劑利用率高、浸出液雜質(zhì)少等優(yōu)勢(shì)。

本研究采用正交試驗(yàn)，以石斛堿、總黃酮含量、浸膏得率和感官評(píng)價(jià)得分為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，對(duì)復(fù)方金釵石斛保健酒的滲漉工藝進(jìn)行優(yōu)化，為原料藥材的提取工藝參數(shù)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金釵石斛飲片：采自瀘州合江金釵石斛種植基地；人參、五味子、黃芪、茯苓（經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)生藥教研室稅丕先教授鑒定）：瀘州百草堂中藥飲片有限公司；濃香型白酒（52度）：瀘州老窖提供；蘆丁對(duì)照品（99.05%，批號(hào)：153-18-4）：成都普思生物科技股份有限公司；石斛堿對(duì)照品（純度99.70%，批號(hào)：111876-201503）、萘對(duì)照品（純度99.6%，批號(hào)：111673-201604）：中國食品藥品檢定研究所；無水乙醇、冰乙酸、香草醛、亞硝酸鈉、硝酸鋁、高氯酸均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HX-200型中藥粉碎機(jī)：浙江省永康市溪岸五金藥具店；UV-I800PC紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；ME204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GC-2010：日本島津公司；10×50 cm滲漉筒：四川聚合化工有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

藥材預(yù)處理：將藥材粉碎至65～80目的藥粉，按人參∶金釵石斛∶黃芪∶五味子∶茯苓（9∶6∶6∶2∶2）的比例混合。

浸潤：按照藥材粉∶白酒=1∶9的比例加入不同酒精度的濃香型白酒，在室溫條件下浸潤不同的時(shí)間。

滲漉：以不同的流速滲漉至料液比為1∶12。

1.3.2 滲漉工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

影響滲漉的主要因素有滲漉速度、提取酒精度以及滲漉前浸潤時(shí)間[14]。因此分別考察滲漉速度（1 mL/（min·kg）、3mL/（min·kg）、5mL/（min·kg）、7mL/（min·kg）、9mL/（min·kg）），提取酒精度（10%vol、38%vol、42%vol、52%vol、68%vol）；浸潤時(shí)間（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）對(duì)滲漉效果的影響。

1.3.3 滲漉工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響滲漉提取的主要因素，滲漉流速（A）、提取酒精度（B）、浸潤時(shí)間（C）3個(gè)因素作為考察對(duì)象，以提取的總黃酮、石斛堿含量、浸膏得率以及感官評(píng)價(jià)的綜合評(píng)價(jià)為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化滲漉提取工藝。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 復(fù)方金釵石斛保健酒滲漉工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of percolation process of compound Dendrobium nobile health liquor

1.3.4 測定方法

總黃酮含量：按照參考文獻(xiàn)[15-17]的方法進(jìn)行測定。

石斛堿含量：按照《中國藥典》（2015版）石斛堿檢測方法進(jìn)行測定。

浸膏得率：精密量取樣品液20mL至質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后在105℃干燥箱中干燥5 h，于干燥器內(nèi)冷卻至室溫，待恒重時(shí)精密稱定，按照下式計(jì)算總固體得率：

感官指標(biāo)評(píng)定方法：參考GB/T 27588—2011《露酒》制定感官評(píng)分方法，來評(píng)定金釵石斛保健酒的色澤、澄清度、香氣及口感，由3名具有5年以上從事白酒的感官評(píng)價(jià)和酒的質(zhì)量檢測人員組成感官評(píng)價(jià)小組，對(duì)不同處理的金釵石斛保健酒樣進(jìn)行感官評(píng)分，記錄結(jié)果，以3人評(píng)分的平均值為最后評(píng)分。

評(píng)價(jià)方法：本課題研究采用多指標(biāo)試驗(yàn)簡易綜合評(píng)分法[18-21]，考慮到保健酒中君臣佐使關(guān)系以及目標(biāo)功效，根據(jù)主成分權(quán)重系數(shù)大原則，總黃酮含量（ai）權(quán)重系數(shù)為0.3，石斛堿含量（bi）權(quán)重系數(shù)為0.3，浸膏得率（ci）權(quán)重系數(shù)為0.2，感官評(píng)分（di）權(quán)重系數(shù)為0.2。

式中：xi為綜合評(píng)分，ai為總黃酮含量，mg/L；bi為石斛堿含量，mg/L；ci為浸膏得率，%；di為感官評(píng)分；S1、S2、S3、S4分別為總黃酮含量、石斛堿含量、浸膏得率、感官評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 滲漉流速的篩選

表2 流速對(duì)滲漉工藝的影響Table 2 Effect of flow velocity on percolation process

由表2可知，隨著滲漉速度的增加，滲漉液的綜合評(píng)分逐漸降低。原因可能是隨流速增加，新鮮溶劑與藥材的接觸時(shí)間減少，溶出成分增加，溶出較多黃酮、生物堿和鞣質(zhì)等苦澀味物質(zhì)，感官得分隨之降低。根據(jù)綜合評(píng)分，選擇低流速滲漉能獲取較好的提取效果，因此選擇滲漉速度為1～5 mL/（min·kg）進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.2提取酒精度的篩選

由表3可知，隨著提取酒精度的增加，總黃酮含量上升，石斛堿先增后減。感官評(píng)價(jià)方面，酒精度升高生物堿類成分溶出增加，致使?jié)楦忻黠@，感官評(píng)價(jià)得分下降。因此在酒精度38%vol、42%vol、52%vol時(shí)既可保證成分最大限度提取出，又可得到感官較好的浸提液。因此選擇提取酒精度為38%vol、42%vol、52%vol進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

表3 提取酒精度對(duì)滲漉工藝的影響Table 3 Effect of alcohol content on percolation process

2.1.3 浸潤時(shí)間的篩選

表4 前浸潤時(shí)間對(duì)滲漉工藝的影響Table 4 Effect of soaking time on percolation process

由表4可知，滲漉提取法在正式滲漉前予以適當(dāng)?shù)慕荩杖苊绞怪M織浸潤膨脹，將有利于溶質(zhì)更好地交換。隨浸潤時(shí)間延長，溶劑進(jìn)入藥材組織交換出的成分越多，本試驗(yàn)中浸潤時(shí)間≥24 h更有利于滲漉效率，功效成分及浸膏得率均呈增加趨勢(shì)。浸潤時(shí)白酒中各類成分與藥材充分反應(yīng)，使藥香酒香復(fù)合協(xié)調(diào)，隨浸潤時(shí)間增加感官評(píng)價(jià)增加。因此選擇浸潤時(shí)間18h、24h、30h進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)

表5 復(fù)方金釵石斛保健酒滲漉工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results of orthogonal test for optimization of percolation process of compound Dendrobium nobile health liquor

由表5可知，影響滲漉的各因素次序?yàn)镃（浸潤時(shí)間）＞A（滲漉流速）＞B（提取酒精度），最優(yōu)水平組合為A1B3C1，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)的時(shí)間成本的影響，將最優(yōu)工藝調(diào)整為A3B3C1，即復(fù)方浸泡于9倍體積的52%vol白酒中18 h，以5 mL·（min·kg）-1流速滲漉。

2.3 最佳工藝穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證最佳工藝的準(zhǔn)確性，在最佳滲漉條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)所得滲漉液石斛堿、總黃酮含量、浸膏得率及感官評(píng)價(jià)分別為183.37 mg/L，219.74 mg/L，24.81%，75分。

3 結(jié)論

最終得出的最佳滲漉提取工藝為人參、金釵石斛、黃芪、茯苓、五味子打粉，過65～80目篩，加入9倍體積的52%vol白酒浸潤18 h，以5 mL/（min·kg）流速滲漉。所得滲漉液石斛堿、總黃酮含量、浸膏得率及感官評(píng)價(jià)分別為183.367 mg/L，219.742 mg/L，24.810%，75分。此方法可作為金釵石斛保健酒的最佳滲漉工藝。