白貝酶解調味液的研制

張 潔，張大為*，田永航

（海南熱帶海洋學院 海南省海洋食品工程技術研究中心，海南 三亞 572022）

白貝又稱為沙白、海貝，是中國文蛤的一種。身體呈扁圓形，體色一般為白色，殼光亮，廣泛分布于廣東湛江、海南的近海地區。貝肉肥美、鮮甜，營養價值非常高，目前以直接食用為主。由于白貝出售過程中極易出現死亡、腐敗的現象，不僅帶來食用安全問題，還是對原料的極大浪費，如果利用這種低價貝類為原料，進行進一步加工成附加值高的產品，將會產生可觀的經濟效益和社會效益[1-3]。隨著社會經濟的高速發展，人們對于高水平生活質量的要求也越來越迫切，調味品也是從最初單為滿足口味需求，慢慢發展為現在對營養、安全、保健等多方面的追求[4-6]。大量研究表明，開發多種調味品是對傳統調味品的補充，從而能夠對水產品進行深度加工，增加低值原料的附加值，將具有廣闊的應用前景[7-15]。天然海鮮調味料因含有豐富的氨基酸、多肽、核苷酸、有機酸等多種呈味物質及多糖、牛磺酸等具有活性的物質，逐漸得到更多消費者的青睞[16-19]。白貝發酵產物含有多種營養物質及活性成分（多糖、短肽等），但是在風味上也存在醇厚感不足等缺點，因此若想將其加工成天然海鮮調味品，仍需對風味進行進一步的改良。

本研究以白貝肉為原料，通過選用適當的蛋白酶水解，得到一種白貝酶解調味液。通過單因素、正交試驗優化酶解工藝條件，并對調味液在酶解過程中生化特性進行了研究。以期提高低值蛋白質的利用率及貝類的附加值又可避免資源浪費所造成的環境污染，促進了水產行業的健康持續發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白貝：市售；枯草芽孢桿菌蛋白酶（10萬U/g）：福建緣菱鑫生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（10萬U/g）、風味蛋白酶（10萬U/g）：河南萬邦實業有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T6型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器責任有限公司；HWS-26型超級恒溫水浴槽、HH型數顯恒溫水浴鍋：金壇市盛藍儀器制造有限公司；FA2204B型電子天平：HANGGPING公司；PB-10型酸度計：德國Sartorius科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 白貝酶解液制備工藝流程及操作要點

白貝→浸泡吐沙→取肉洗凈→白貝肉→打漿→酶解→酶失活→過濾→酶解液

浸泡吐沙：將所用白貝帶殼放置清水中吐沙，放置時間為5 h左右，而后用清水沖洗。

取肉洗凈：浸泡吐沙后用刀進行開殼取肉，并用清水沖洗。打漿：將白貝肉淋干水分后，放在打漿機中打漿，備用。酶解：將白貝肉漿分別置于酶解容器中，加入定量的蛋白酶，分別在最佳條件下酶解。

滅活：酶解后，將酶解液加熱至100℃，保溫5min，滅活。

過濾：采用無菌紗布，進行簡單過濾得到酶解液。

1.3.2 白貝酶解液工藝參數單因素試驗

（1）不同蛋白酶水解效果的比較

在4支10 mL試管中各加入10 g白貝肉漿，分別加入0.16 g/10 g原料枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶，以不加蛋白酶作為對照，在pH7.5、55℃的條件下水解4 h，考察蛋白酶種類對水解效果的影響。

（2）酶添加順序對水解效果的影響

固定酶添加量為0.16 g/10 g原料，兩種酶添加比例為1∶1，在pH值為7.5、55 ℃條件下水解4 h，考察酶添加順序對水解效果的影響。

（3）復合酶比例對水解效果的影響

固定酶添加量為0.16g/10g原料，分別設定枯草芽孢桿菌中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶添加比例為3∶1、2∶1、1∶2、1∶3、1∶4時，在pH值為7.5、55℃條件下水解4 h，考察兩種酶添加比例對水解效果的影響。

（4）復合酶最佳添加量的確定

固定枯草芽孢桿菌中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3的比例，在pH值為7.5，55℃條件下水解4 h，分別調整酶添加量為0.12 g、0.14 g、0.16 g、0.18 g、0.20 g/10 g原料，考察總加酶量對水解效果的影響。

（5）復合酶最佳水解時間的確定

固定復合酶添加量為0.16 g/10 g原料，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3的比例，在pH值為7.5，55 ℃條件下分別酶解為2 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4 h，考察水解時間對水解效果的影響。

（6）復合酶最佳水解溫度的確定

（7）復合酶最佳水解pH的確定

固定復合酶添加量0.16g/10g原料，最佳水解溫度55℃，水解時間2.5 h，分別調整試液pH值分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5時，考察復合酶最適水解pH值。

1.3.3 白貝酶解液工藝參數的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以水解度（degree ofhydrolysis，DH）為評價指標，選取4個因素進行正交試驗，從而進一步確定最佳酶解工藝參數。

表1 白貝肉漿酶解條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for white shellfish pulp enzymatic hydrolysis condition optimization

1.3.4 酶解過程中pH值、氨基酸態氮含量、揮發性鹽基氮含量的變化

在最佳工藝條件下，選取0h、1h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5 h七個時間點，考查白貝酶解過程中pH值、氨基酸態氮含量、揮發性鹽基氮含量的變化情況。

1.3.5 測定方法

二是審查過程沒有相關規定。審查過程中如何對報備規章進行審查的問題，《立法法》以及《法規規章備案條例》缺少明確的規定。《立法法》第九十九條規定了主動審查條款，第一百條規定了審查意見的協商條款。各地對于報備規章的審查過程性規定也大體類似，如陜西規定省人大常委會審查機構認為報備規章存在問題的，應向常委會主任會議提出審查意見和處理意見報告，對于市政府規章交市人大常委會處理。實踐中，通過協商溝通的方式提出意見交換看法，可以說是基于一種內部溝通協商的柔性機制，剛性約束和監督權威性不足，一方面有著中國特色的體制內協商成本低的優勢，另一方面降低了審查工作的嚴肅性和權威性，也降低了審查工作的效率。

pH值測定：利用PB-10型酸度計測定；揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）：采用微量擴散法（參見GB 5009.228—2016的測定方法）[20]；總氮含量、總非蛋白氮：利用凱氏定氮法測定[21]；氨基酸態氮含量：采用中性甲醛電位滴定法測定[21]。水解度計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 白貝酶解單因素試驗結果

2.1.1 不同蛋白酶水解效果的比較結果

圖1 不同蛋白酶水解白貝效果比較Fig.1 Comparison of hydrolysis effect of white shellfish with different protease

由圖1可知，相比不添加蛋白酶，3種蛋白酶水解效果均較好，其中枯草中性蛋白酶的水解效果最好，水解度達到55.6%；其次是添加木瓜蛋白酶和風味蛋白酶，水解度分別為49.2%和32.5%。故選取枯草中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進行后續試驗。

2.1.2 蛋白酶不同添加順序對水解效果的影響

圖2 蛋白酶添加順序對水解效果的影響Fig.2 Effect of protease addition order on hydrolysis

從圖2可知，同時加入兩種蛋白酶時水解度為57.2%，先加枯草中性蛋白酶和先加木瓜蛋白酶的水解度分別為54.4%和48.6%。從圖2可以看出，加入方式對水解度具有顯著影響。原因可能是兩種酶的作用方式有所差別，另外，兩種酶在水解蛋白質過程中，具有協同作用效果。故本試驗后續采用同時加入兩種酶的方式來進行。

2.1.3 復合蛋白酶添加比例對水解效果的影響

圖3 復合蛋白酶添加比例對水解效果的影響Fig.3 Effect of adding ratio of compound protease on hydrolysis

由圖3可知，隨著木瓜蛋白酶含量的增加水解度呈上升趨勢，比例達到1∶3時，水解效果最好，水解度達到59.6%，比例1∶4時水解效果有所下降。可能由于添加比例為1∶3時，兩種酶的協同作用最為明顯。故本試驗選取枯草芽孢桿菌中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為1∶3。

2.1.4 復合酶添加量對水解效果的影響

圖4 復合酶添加量對水解效果的影響Fig.4 Effect of compound enzyme addition on hydrolysis

由圖4可知，復合酶的添加量與水解效果呈正比例關系，隨著酶量的增加，水解度逐漸增加。當酶加量達到0.16g/10g時，水解效果最好，水解度達到59.2%。隨著酶量的繼續增加，水解效果趨于平穩。故本試驗選取最適復合酶添加量為0.16 g/10 g。

2.1.5 復合酶酶解時間對水解效果的影響

圖5 酶解時間對水解效果的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis

由圖5可知，隨著水解時間的延長，水解度逐漸增高，水解時間為2.5 h時，水解度達到最高值59.6%，隨著水解時間的延長水解度趨于穩定，即蛋白質水解達到平衡。故本試驗選取復合酶最佳的酶解時間為2.5 h。

2.1.6 復合酶酶解溫度對水解效果的影響

圖6 酶解溫度對水解效果的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on hydrolysis

由圖6可知，酶解溫度對復合酶水解效果具有很大的影響，復合酶酶解溫度為50℃時，水解度達到59.8%。當溫度達到55℃時，水解度略有下降不顯著。隨著溫度的升高，水解度呈下降的趨勢，說明更高的溫度已經不適合復合酶的酶解作用。故本試驗選取復合酶酶解溫度為50℃。

2.1.7 復合酶酶解pH值對水解效果的影響

圖7 酶解pH值對水解效果的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis pH on hydrolysis

由圖7可知，當反應基質初始pH為7.0和7.5時，水解效果比較好，pH值為7.5時水解度達到59.6%，隨著pH值的升高，水解效果顯著下降，原因是pH值改變會影響復合酶的本身活性，從而降低其水解效果。故本試驗選取酶解pH值為7.5。

2.2 白貝酶解液最佳酶解條件的正交試驗

表2 白貝肉漿酶解條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for white shellfish pulp enzymatic hydrolysis condition optimization

從表2可知，最佳酶解條件組合為A3B3C2D1，即酶解溫度為55℃，酶解時間為3 h，酶解pH值為7.5，復合酶添加量為0.16 g/10 g。在此優化條件下，酶解液水解度為60.02%。

根據極差R分析得出，4個因素對酶解效果的作用顯著性有不同，按影響大小分是A＞B＞C＞D，也就是說，溫度是影響整個酶水解的最重要因素，其次是時間和pH值，影響最小的是加酶量。

2.3 白貝肉漿酶解過程中pH值的變化

將白貝肉漿初始pH值調節為7.5，考查酶解過程中pH的變化，如圖8所示。由圖8可知，隨著時間的延長，酶解液的pH值在0～1.5 h之內從7.5降至7.1，2 h后pH值降至6.9左右并趨于穩定。原因是蛋白質降解為氨基酸，從而改變酶解液的pH值。

圖8 白貝肉漿酶解過程中pH值的變化Fig.8 Changes of pH during enzymatic hydrolysis of shellfish meat pulp

2.4 白貝肉漿酶解過程中氨基酸態氮含量的變化

白貝肉漿中蛋白質在水解過程中，蛋白質開始水解為氨基酸，如圖9所示，整個過程中，氨基酸態氮含量呈先上升后趨于穩定的趨勢，說明隨著時間的進行氨基酸含量逐步增加，到2.5 h達到最高值1.26 g/100 mL，繼續水解氨基酸態氮含量趨于穩定，說明水解達到平衡狀態，此含量已經達到特級醬油的標準，所以白貝水解液作為調味液是具有潛力的。

圖9 白貝肉漿酶解過程中氨基酸態氮含量的變化Fig.9 Changes of amino acid nitrogen content during enzymatic hydrolysis of shellfish meat pulp

2.5 白貝肉漿酶解過程中揮發性鹽基氮的變化

揮發性鹽基氮是衡量水產品腐敗的一個重要指標，GB/T 21999—2008《蠔油》中規定揮發性鹽基氮的含量應≤50mg/100mL。由圖10可知，本試驗中揮發性鹽基氮從水解開始逐步呈上升的趨勢，2.5h達到最大值12.32mg/100mL，繼續水解其含量趨于穩定。說明整個生產過程揮發性鹽基氮含量相對較低，符合國標的要求。

圖10 白貝肉漿酶解過程中揮發性鹽基氮含量的變化Fig.10 Changes of volatile base nitrogen content during enzymatic hydrolysis of shellfish meat pulp

3 結論

通過單因素試驗、正交試驗研究表明，白貝酶解調味液最佳工藝條件為采用同時加入枯草芽孢桿菌中性蛋白酶和木瓜蛋白酶兩種酶，添加比例為1∶3，總加酶量為0.16 g/10 g原料，水解溫度為55℃，時間為3 h，初始pH值為7.5，在此條件下，所得水解度為60.02%。酶解過程中pH從初始7.5逐步降低，2 h后降至6.9并趨于穩定；氨基酸態氮含量呈逐漸升高的趨勢，2.5 h達到最高值1.26 g/100 mL，而后趨于穩定；揮發性鹽基氮也呈先升高后穩定的趨勢，2.5 h后達到最高峰12.32 mg/100 mL。