豬胰臟中胰蛋白酶提取條件優(yōu)化

岳曉禹，范露露，蔡青和，李長(zhǎng)濱，楊盛茹

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450046）

在悠長(zhǎng)的農(nóng)業(yè)歷史和獨(dú)特的飲食文化的影響下，中國(guó)人對(duì)豬肉有種特殊的喜好，也使得中國(guó)成為世界第一的生豬養(yǎng)殖和消費(fèi)大國(guó)[1]。肉制品消費(fèi)的數(shù)量龐大，導(dǎo)致大量不可食用的胰臟造成浪費(fèi)，胰臟中含有的酶容易自溶，直接導(dǎo)致了環(huán)境的污染。胰臟含有多種可以利用的酶資源，從其中提取這些酶，不僅可以廢物利用而且保護(hù)環(huán)境。

豬胰臟中最重要的酶之一就是胰蛋白酶，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。從動(dòng)物胰臟中提取的胰蛋白酶屬于中外藥典收錄的助消化藥。胰蛋白酶是一種堿性蛋白酶[2]，屬于水解酶的一種[3]。前體無(wú)活性，受腸激酶的刺激被激活。不同來(lái)源的胰蛋白酶相對(duì)分子質(zhì)量不同，但大都在24 000 Da左右，等電點(diǎn)為10.8，最適pH值為7.6～8.0[4]。胰蛋白酶一般存在于高等動(dòng)物胰液和低等動(dòng)物胃液中[5]，作用特性單一[6]，只專(zhuān)一作用于精氨酸和賴(lài)氨酸參與形成的肽鍵，促進(jìn)絲氨酸殘基中蛋白質(zhì)的斷裂，在動(dòng)物的消化系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，通常用于消化細(xì)胞間的軟組織[7]。胰蛋白酶在各種行業(yè)中仍然有很大的需求[8-9]。臨床上應(yīng)用于外科炎癥、潰瘍、膿胸、血胸、創(chuàng)傷性損傷等。除了其的臨床意義外，在牛奶工業(yè)、蛋白質(zhì)組學(xué)和各種食品加工工序中也有著極高的應(yīng)用，特別是在動(dòng)物細(xì)胞組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室有著極其廣泛的應(yīng)用[10]。

國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者對(duì)提取胰蛋白酶方面有不少的研究，早些時(shí)候提取胰蛋白酶大都采用低溶度有機(jī)溶劑（如25%乙醇、10%丙酮、7.5%異丙醇等）提取，通過(guò)氯化鈣和胰酶粉進(jìn)行激活，最后用高濃度有機(jī)溶劑沉淀的方法。但近些年來(lái)提取胰蛋白酶的工藝有了很大的改變，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑的毒性和對(duì)人體的危害，各位專(zhuān)家學(xué)者開(kāi)始使用非有機(jī)溶劑對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行提取，在激活劑和保護(hù)劑的選擇上也有了很多的改變。如周紅航等[11]采用蒸餾水提取，氯化鈣和胰酶粉激活，根據(jù)胰蛋白酶各方面的性質(zhì)用聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行純化，最后酶活達(dá)到了1780U/mL；劉亮亮等[12]在2010年研究了胰蛋白酶提取工藝，采用Tris-HCl緩沖液為提取劑，氯化鈣和胰蛋白酶粉為激活劑，鹽析方法進(jìn)行提純，最終酶比活力達(dá)到6600BAEE/mg，該方法雖然具有很高的提取效率，但要消耗大量的有機(jī)溶劑；余武英等[13]在2011年也采用蒸餾水提取，氯化鈣和胰酶粉激活，用聚乙二醇使胰蛋白酶得到沉淀分離，最終酶活力達(dá)到1 600 U/mL以上，比鹽析法提取率高，操作簡(jiǎn)單；丁凌霄等[14]在2013年用乙酸酸化水提取，鹽析法粗提，氯化鈣和胰蛋白酶激活，親和層析分離純化胰蛋白酶，酶活達(dá)到256 U/mL；李明生等[15]在2017年用蒸餾水提取，通過(guò)對(duì)激活條件的優(yōu)化研究出當(dāng)氯化鈣濃度為0.2 mol/L為最佳激活條件，經(jīng)二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-瓊脂糖凝膠FF純化后其酶活力為3980U/mg，酶活得到顯著提高。

本試驗(yàn)對(duì)胰蛋白酶制備進(jìn)行研究，以期減少有機(jī)溶劑在提取過(guò)程中的使用，相對(duì)提高胰蛋白酶的活力，打破有機(jī)溶劑消耗量大的問(wèn)題，減少有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境和人體的危害。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍豬胰臟、豬十二指腸、膽囊：某公司提供；Tris-HCl緩沖液、三羥甲基氨基甲烷：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；干酪素：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸對(duì)照品：德國(guó)Sigma公司；NaCl、Na2HPO4：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4：北京西隴化工股份有限公司；試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PY-790絞肉機(jī)：中山市鵬宇電器有限公司；IS139FD-V2 pH計(jì)：上海儀邁儀器科技有限公司；UV759CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬胰臟中胰蛋白酶提取工藝試驗(yàn)流程及操作要點(diǎn)

冷凍豬胰臟打漿→提取→激活→濃縮→胰蛋白酶

操作要點(diǎn)：

冷凍豬胰臟打漿：實(shí)驗(yàn)先用剪刀去除大塊脂肪、結(jié)締組織，再用絞肉機(jī)來(lái)破碎胰臟。

提取：取10 g胰漿，按200 mL/100 g比例加入20 mL提取劑（預(yù)冷至4℃）進(jìn)行提取，使胰蛋白酶細(xì)胞充分溶解在溶液中。胰蛋白酶的活性在4℃時(shí)比較穩(wěn)定[16]，所以整個(gè)操作過(guò)程在4℃條件下進(jìn)行。

激活：在上述溶液中加入激活劑激活胰蛋白酶，在此過(guò)程中為了減少蛋白酶的降解失活加入1%氯化鈉和1%甘油作為保護(hù)劑，調(diào)節(jié)pH為8.0，充分?jǐn)嚢瑁?℃條件下激活18 h，兩層紗布過(guò)濾，得到濾液，濾渣再次提取，合并兩次提取液。

濃縮：用截留分子質(zhì)量為10 000 Da的透析袋對(duì)胰蛋白酶液進(jìn)行濃縮，把透析袋剪成約10 cm的小段，用蒸餾水煮沸10～15 min左右，透析袋的一端用夾子夾到位，取10 mL胰蛋白酶液從透析袋另一端倒入，最后用夾子夾到位。把處理好的裝有胰蛋白酶液的透析袋放入干凈的燒杯中，倒入配好的聚乙二醇（聚乙二醇∶蒸餾水=30∶100），倒入的聚乙二醇的量以正好浸入透析袋為準(zhǔn)，最后在4℃條件下進(jìn)行濃縮。燒杯中的聚乙二醇1～2h換一次，5～6h換一次，最后放置過(guò)夜，制成胰蛋白酶。

1.3.2 胰蛋白酶活力測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2015年版第二部進(jìn)行測(cè)定[17]。測(cè)定過(guò)程稍有改動(dòng)，因?yàn)闇y(cè)定的胰蛋白酶液是液體，所以藥典中用氯化鈣溶液溶解定容胰蛋白酶粉的過(guò)程省略，其余步驟和藥典都相同。

胰蛋白酶活力定義：每分鐘水解酪蛋白生成三氯醋酸不沉淀物在波長(zhǎng)275 nm處與1 μmol酪氨酸相當(dāng)?shù)拿噶浚瑸?個(gè)胰蛋白酶活力，U/mL。

1.3.3 胰蛋白酶提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別考察不同提取劑（0.15 mo1/L氯化鈉、蒸餾水、磷酸鹽緩沖液（pH6.8）、0.05 mo1/L Tris-HCl緩沖液），激活劑（0.06%CaCl2+豬十二指腸（豬胰臟∶十二指腸=8∶1，下同），0.2%CaCl2+1%膽汁，0.2%CaCl2+1%胰酶粉，0.2%CaCl2+豬十二指腸），提取pH值（2、4、6、8、10、12、14），提取時(shí)間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h）對(duì)胰蛋白酶酶活的影響。

1.3.4 胰蛋白酶提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)確定最優(yōu)方案。

表1 豬胰臟中胰蛋白酶提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of extraction conditions of trypsin in pig pancreas

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取劑種類(lèi)對(duì)胰蛋白酶酶活的影響

圖1 提取劑種類(lèi)對(duì)胰蛋白酶酶活的影響Fig.1 Effect of types of extraction enzymatic activity of trypsin

由圖1可知，當(dāng)提取劑為0.15 mol/L NaCl時(shí)，胰蛋白酶酶活較低，為150 U/mL；當(dāng)提取劑分別為蒸餾水、磷酸鹽溶液、0.05 mol/L Tris-HCl時(shí)，胰蛋白酶酶活分別為171 U/mL、176 U/mL、187 U/mL，沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。但是因?yàn)門(mén)ris-HCl是有機(jī)溶劑，大量使用會(huì)造成浪費(fèi)和環(huán)境污染，所以不宜使用，因此選擇蒸餾水、磷酸鹽緩沖液、0.15 mol/L Tris-HCl進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 激活劑種類(lèi)對(duì)胰蛋白酶酶活的影響

圖2 激活劑種類(lèi)對(duì)胰蛋白酶酶活的影響Fig.2 Effect of activation agents types on enzymatic activity of trypsin

由圖2可知，當(dāng)激活劑為0.2%CaCl2+1%膽汁時(shí)，蛋白酶酶活為120 U/mL；當(dāng)激活劑分別為0.2%CaCl2+1%胰酶粉、0.2%CaCl2+豬十二指腸、0.06%CaCl2+豬十二指腸時(shí)，酶活分別為221 U/mL、244 U/mL、268 U/mL，沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），因此選擇0.2%CaCl2+1%胰酶粉、0.2%CaCl2+豬十二指腸、0.06%CaCl2+豬十二指腸進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 提取pH值對(duì)胰蛋白酶酶活的影響

圖3 提取pH值對(duì)胰蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effect of extraction pH on enzymatic activity of trypsin

由圖3可知，胰蛋白酶酶活隨著pH值的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)。在pH2～8范圍內(nèi)，酶活力差異顯著（P＜0.05），在pH=8時(shí)酶活達(dá)到最高，為215 U/mL，pH值由8升至14時(shí)，酶活力急劇下降，差異顯著（P＜0.05）。酸性或堿性過(guò)強(qiáng)都會(huì)導(dǎo)致胰蛋白酶失活。因此選擇pH值8為最佳提取pH值。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)胰蛋白酶酶活的影響

圖4 激活時(shí)間對(duì)胰蛋白酶酶活的影響Fig.4 Effect of activation time on enzymatic activity of trypsin

由圖4可知，隨著激活時(shí)間的延長(zhǎng)，胰蛋白酶酶活呈先升高后降低的趨勢(shì)，在2～18 h范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力急劇增加，差異顯著（P＜0.05），在18 h時(shí)酶活達(dá)到最高，為342 U/mL，在18～22 h范圍內(nèi)酶活慢慢下降與最高值沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），因此選擇最佳激活時(shí)間為18 h。選擇最佳激活時(shí)間不僅可以充分激活胰蛋白酶，還可以避免激活后胰蛋白酶本身的降解，這是把握激活時(shí)間的關(guān)鍵[19]。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，對(duì)酶活影響主次因素為提取pH值＞提取時(shí)間＞激活劑＞提取劑。豬胰臟蛋白酶提取最優(yōu)方案為A3B1C1D2，即提取劑為0.15 mo1/L氯化鈉，激活劑為0.06%的CaCl2和豬十二指腸，提取pH值為6，提取時(shí)間為18h。上述得出的最優(yōu)方案是不是真正的最優(yōu)方案還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，將優(yōu)方案A3B1C1D2與正交表中最好的第6號(hào)試驗(yàn)A2B3C1D2作對(duì)比試驗(yàn)，得出酶活為424 U/mL，比第6號(hào)試驗(yàn)結(jié)果高，所以A3B1C1D2為最優(yōu)方案。

2.3 胰蛋白酶的濃縮

表3 透析前后酶活的變化Table 3 Changes of enzyme activity before and after dialysis

由表3可知，透析24 h后的酶活是藥典要求酶活（每1 g胰酶中含胰蛋白酶活力≥600單位）的4.19倍。選擇透析袋和聚乙二醇吸水相結(jié)合的方式對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行濃縮，此方法濃縮效果好，操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)成本低。

3 結(jié)論

胰蛋白酶制備的最佳提取劑為0.15 mo1/L氯化鈉，激活劑為0.06%的CaCl2和豬十二指腸，提取pH值為6，提取時(shí)間18 h，經(jīng)透析袋濃縮之后酶活達(dá)到2 512 U/mL，是藥典要求酶活的4.19倍。本實(shí)驗(yàn)提取胰蛋白酶方法簡(jiǎn)單，通過(guò)透析對(duì)胰蛋白酶液進(jìn)行簡(jiǎn)單的濃縮之后酶活顯著提高，經(jīng)濟(jì)成本低，應(yīng)用價(jià)值高。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，提取出來(lái)的成品仍存在其他大分子酶，與其他優(yōu)秀的研究者提取出的蛋白酶酶活相比還是有很大差距，在尋求提取胰蛋白酶更加經(jīng)濟(jì)的方式基礎(chǔ)上，酶活仍存在很大的進(jìn)步空間。期望在以后的學(xué)習(xí)和工作中能有機(jī)會(huì)進(jìn)一步探討胰蛋白酶的提純進(jìn)而提高酶活。