煙草廢水中紅色酵母菌的分離鑒定及其胞內色素和油脂的初步研究

張可可，席 宇，程 方，劉 凱，陰紅霞，房占杰，劉人聚，史團省，劉 巖*

（1.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001；2.河南省農業科學院 農業質量標準與檢測技術研究所，河南 鄭州 450002；3.鄭州大學 農學院，河南 鄭州 450001）

紅色酵母菌是一類重要的資源微生物，其細胞內可積累類胡蘿卜素[1-3]和油脂[4-5]等多種生物活性物質[6-7]。目前，已從環境中分離出多株紅色酵母菌[8-9]。作為一種紅色酵母菌，鎖擲孢酵母（Sporidiobolus）的多個菌株能高產油脂，是微生物油脂開發的理想研究對象[10]，而且鎖擲孢酵母油脂中富含油酸，可作為功能性油脂的一種來源[11]。此外，鎖擲孢酵母合成類胡蘿卜素[12-14]的特性也引起研究人員的極大興趣。因此，鎖擲孢酵母在食品加工[15]、腐敗菌防治[16]和醫藥研發[12]等領域的應用日趨增多，利用鎖擲孢酵母細胞積累油脂、色素、酶類等有益代謝產物的特性受到研究者的重視[17-18]。

煙草廢水中含有大量可溶性糖類物質，且其pH值為弱酸性，適合真菌類微生物生長[19-20]。近年來，有關煙葉內生真菌的研究較多[21-24]，而對煙草廢水中微生物類群的研究甚少。本研究采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基從煙草廢水中分離一株紅色酵母菌，通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行鑒定，并初步探討其發酵馬鈴薯葡萄糖水（potato dextrose water，PDW）產油脂和色素的潛力，旨在為紅色酵母菌天然產物的開發和有機釀造廢水的資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

煙草廢水：河南卷煙工業煙草薄片有限公司污水處理站。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Ladder Mix Marker：生工生物工程（上海）股份有限公司；鹽酸（分析純）：洛陽昊華化學試劑有限公司；丙酮（分析純）：河南省金碩化學試劑有限公司；乙醇（分析純）：新鄉市三偉消毒制劑有限公司；氯仿（分析純）：天津市科密歐化學試劑開發中心；甲醇（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖水（PDW）：青島海博生物技術有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：北京陸橋技術股份有限責任公司。

1.2 儀器與設備

JJ300精密電子天平：常熟雙杰測試儀器廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；YXQ-LS-30SII高壓蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司；Avanti J-25低溫高速離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；GHP-9160恒溫振蕩培養箱：太倉市實驗設備廠；Microstation自動微生物鑒定儀：美國Biolog公司；GHP-9160隔水式恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；WH861漩渦混合器：上?？等A生化儀器制造公司；UV1700紫外分光光度計：日本島津公司；3730XL測序儀：美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離

將采集的煙草廢水用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋（10-1～10-5），然后將梯度稀釋液分別涂布于PDA培養基，30℃條件下培養至出現紅色菌落，采用PDA培養基劃線純化，獲得單菌落，4℃保藏于PDA培養基斜面，備用。

1.3.2 分離菌株的鑒定

形態觀察[25]：將分離菌株劃線于PDA培養基，30℃培養48 h，觀察菌落特征，在顯微鏡下觀察細胞形態。

生理生化試驗[26]：采用Microstation自動微生物鑒定儀對分離菌株的碳源利用情況進行檢測。

分子生物學鑒定：分離菌株ITS序列的擴增及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司進行，序列同源性分析及系統發育樹的構建參考文獻[25]進行。

1.3.3 分離菌株的培養

挑取一環分離菌株接種于含20 mL PDW的100 mL三角瓶中，30℃、150r/min條件下培養18h制備種子液。取5mL種子液接種于含45 mL PDW的250 mL三角瓶中，30℃、150 r/min條件下培養4 d，測定生物量、胞內油脂及色素。

1.3.4分析方法

生物量的測定[27]：取20mL發酵液，8000r/min離心5min，棄上清，收集菌體，稱質量并計算菌體濕質量，105℃烘至恒質量后，稱質量并計算菌體干質量。

菌體胞內油脂的提取和含量測定[28]：采用酸熱法提取菌體胞內油脂。1 g濕菌體加入4 mol/L鹽酸10 mL，混合均勻，室溫放置20 min后沸水浴10 min，-20 ℃冰浴30 min，加入氯仿和甲醇各10 mL，振蕩30 min，5 000 r/min離心3 min，靜置分層，分離下部氯仿層，65℃干燥2 h，稱質量并計算油脂含量及產量。

色素的提取與含量測定[29-30]：在1g濕菌體中加入4mol/L的鹽酸溶液6 mL，室溫振蕩浸泡30 min，沸水浴5 min，冰水混合物中迅速冷卻10 min后進行細胞破碎。在細胞破碎液中加入4 mL丙酮，避光振蕩30 min，離心收集丙酮浸提液。采用紫外可見分光光度計在波長400～600nm處對丙酮浸提液進行掃描，獲得最高吸收波長及其對應的吸光度值，計算色素的產量。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

經多次劃線純化，從PDA培養基平板上分離出一株紅色單菌落，命名為YH0902，采用形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行鑒定。

2.2 菌株YH0902的鑒定

2.2.1 形態觀察

菌株YH0902在PDA培養基上的菌落及細胞形態見圖1。由圖1a可知，該菌落呈玫紅色，濕潤不透明，菌落凸起，表面光滑，邊緣完整。由圖1b可知，菌株YH0902的細胞呈橢圓形，有明顯的芽體產生，部分細胞內有明顯的高折光率顆粒區域，可能是富集油脂的原因。根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》可知，菌株YH0902的菌落特征與細胞形態特征與酵母菌高度相符[31-32]。

圖1 菌株YH0902的菌落（a）和細胞（b）形態Fig.1 Colony(a)and cell(b)morphology of strain YH0902

2.2.2 生理生化特征分析

菌株YH0902的碳源利用結果見表1。由表1可知，菌株YH0902可以利用D-阿洛酮糖、L-山梨糖、D-苷露醇、麥芽三糖、D-棉子糖、α-D-葡萄糖、D-半乳糖磺，琥珀酸和D-木糖等碳源；不能利用乙酸、D-纖維二糖、N-乙?；鵇-葡萄糖、麥芽糖醇、I-赤藻糖醇等碳源。

表1 菌株YH0902的碳源利用結果Table 1 Results of carbon source utilization of strain YH0902

2.2.3分子生物學鑒定

以菌株YH0902基因組為模板，ITS 1、ITS 2為引物進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產物的電泳條帶位于500～600 bp，與預期結果相符。

圖2 菌株YH0902的ITS序列PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified products of ITS sequence of strain YH0902

測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數據庫中進行BLAST同源性比對，選取同源性較高的12株酵母菌，采用MEGA 6.05軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統進化樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株YH0902與近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）聚于同一分支，親緣關系最近。結合菌株YH0902的形態觀察及生理生化試驗結果，鑒定其為一株近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。

圖3 基于ITS序列菌株YH0902的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YH0902 based on ITS sequences

2.3 菌株YH0902胞內色素及油脂的初步分析

采用紫外可見分光光度計在波長400～600 nm處對丙酮浸提液進行掃描，結果見圖4。由圖4可知，菌株YH0902細胞色素的丙酮提取液的掃描圖譜與類胡蘿卜素的掃描光譜圖基本一致[29]，具有明顯的雙肩峰特征，最大吸收波長為488 nm。因此，可以推測菌株YH0902細胞內含有大量的類胡蘿卜素。

圖4 菌株YH0902胞內色素丙酮提取液的掃描光譜Fig.4 Scanned spectrum of intracellular pigment acetone extracting solution of strain YH0902

菌株YH0902的生物量、胞內油脂及色素的分析結果如表2所示。由表2可知，菌株YH0902在PDW中，30℃、150r/min條件下培養4 d，發酵液中菌體濕質量為（48.53±0.36）g/L，干質量為（10.63±0.15）g/L。菌株YH0902油脂產量可達（3.30±0.17）g/L，占細胞干質量的（31.04±0.23）%，油脂含量相對較高。菌株YH0902胞內色素產量為（4.33±0.19）mg/L。本實驗采用商品化PDW進行發酵，成本較高，但生物量相對較低。因此，下一步的實驗需要探索廉價的基質進行發酵培養，如食品釀造廢水等，通過發酵優化和營養物質的添加，提高發酵產物色素或油脂的產量。

表2 菌株YH0902的生物量、胞內油脂及色素Table 2 Biomass,intracellular lipid and pigment of strain YH0902

3 結論

本研究采用PDA培養基從煙草廢水中分離出一株紅色酵母菌YH0902，通過形態觀察、生理生化實驗及分子生物鑒定其為一株近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。該菌株可利用PDW培養基產生油脂和色素，30℃、150r/min條件下培養4d，濕質量為（48.53±0.36）g/L，干質量為（10.63±0.15）g/L，胞內油脂產量可達（3.30±0.17）g/L，色素產量為（4.33±0.19）mg/L。因此，菌株YH0902在微生物源天然色素及油脂開發領域具有一定的應用前景。