辣木葉毛霉固態發酵過程中主要營養成分及其抗氧化活性的動態變化研究

張云娟，田 洋，周 學，趙丹丹，李凌飛*

(1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201; 2. 云南省農業科學院農業經濟與信息研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】辣木(MoringaoleiferaLam)又稱鼓槌樹、奇跡之樹，為辣木科辣木屬植物。辣木全身都是寶，其根、莖、葉、花、種子、樹皮、樹膠均可食用或藥用。辣木含有豐富的營養物質，近年來，辣木以高蛋白、高鈣、高纖維、高維生素、低脂肪的健康特性以及降血糖、降血壓、降血脂、抗氧化、抗病毒、消炎抑菌等保健功效而成為健康食品界的新寵，被譽為新時代健康食物[1]。同時，作為“新資源食品”的辣木葉，也在2012年被中國綠色發展中心認定為“國家首推綠色食品”。固態發酵作為一種高效且經濟的發酵技術，已在食品加工中被廣泛利用[2]。由于在發酵過程中，微生物可以產生一系列復雜的酶系，能夠促進一些生物活性成分的產生。因此，通過微生物發酵改善口感、提高原料的營養價值或產品的生物活性已成為當前研究的熱點。【前人研究進展】研究表明，一些食品原料經微生物發酵后其生物活性大大提高。管瑛等[3]人研究了米根霉和少孢根霉對豆渣固態發酵過程中主要營養成分及其抗氧化特性的影響，結果表明發酵提高了豆渣的營養成分及抗氧化活性。趙丹[4]等人研究了真菌固態發酵紫米過程中營養成分的變化，結果表明真菌發酵的紫米具有更高的營養價值，具有潛在的作為緩解高血壓輔助療法的功能食品的能力。近年來，關于辣木發酵物營養成分及其功能活性的研究報道較少。研究表明，辣木發酵后的提取物可以降低高脂飲食誘導的小鼠肥胖癥狀并改善葡萄糖耐受量[5]。Zhang等[6]研究了短小芽孢桿菌發酵辣木葉過程中營養成分及其抗氧化活性的變化，表明短小芽孢桿菌發酵能提高辣木葉粉中可溶性蛋白的含量、總酚含量以及抗氧化活性。【本研究切入點】魯氏毛霉(Mucorroxianus)為毛霉科魯氏毛霉屬真菌，它能產生大量蛋白酶，具有較強的分解蛋白的能力。蛋白質分解可產生多肽、小分子短肽及氨基酸。辣木葉中含有豐富的蛋白質。目前，利用毛霉發酵辣木葉的研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以辣木葉為原料，通過魯氏毛霉進行固態發酵，檢測發酵過程中發酵物的可溶性蛋白、游離氨基酸、可溶性多糖、多酚等主要營養成分的含量變化，測定蛋白酶、纖維素酶和糖化酶的活力，探討發酵物的抗氧化能力，為利用辣木葉開發相關功能性食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

辣木葉粉購于德宏天佑科技有限公司，過100目篩。

菌種：魯氏毛霉(Mucorrouxianus)由云南農業大學食品科學技術學院食品微生物實驗室保存。

實驗試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養基、沒食子酸、福林酚、酪氨酸、酪蛋白、羧甲基纖維素鈉、可溶性淀粉、DPPH、ABTS、過硫酸鉀購自北京索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白V5購自上海伯奧生物科技有限公司；考馬斯亮藍G250、谷氨酸、葡聚糖、蒽酮、茚三酮、氯化亞錫購于上海源葉生物科技有限公司；3, 5-二硝基水楊酸、硫酸、磷酸、無水乙醇、三氯乙酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉購于重慶川東化工(集團)有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀購于西隴化工股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液制備 挑取少量魯氏毛霉接種于PDA培養基上，28 ℃恒溫培養3 d進行菌種活化。然后挑取活化的毛霉菌絲接種于PDB液體培養基中，28 ℃ 150 rpm恒溫搖瓶培養3 d，獲得含大量魯氏毛霉孢子的種子液備用。

1.2.2 固體發酵實驗 將上述種子培養液按接種量5 %添加于滅菌后的辣木葉粉中，用無菌水調節辣木葉粉的濕度為60 %，28 ℃恒溫發酵15 d。實驗設置4個重復樣本。在發酵期間，每天輕輕抖動培養瓶，使菌絲和辣木葉粉充分混合均勻。分別于發酵前、發酵3、6、9、12、15 d取樣，經真空冷凍干燥后，進行主要營養成分、酶活力和抗氧化能力檢測。

1.3 主要營養成分測定

1.3.1 可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍染色法[7]測定樣品中可溶性蛋白的含量。以牛血清蛋白(BSA)作為標準品，以BSA含量為橫坐標(X)，以吸光度為縱坐標(Y)，獲得標準曲線方程為Y=0.7443X+0.0055(R2=0.9993)。取1 mL樣品溶液至試管中，加入4 mL考馬斯亮藍G250染液，搖勻，室溫放置3 min，以0 mL試管為空白，在595 nm測定吸光度。根據標準曲線方程計算樣品中可溶性蛋白的含量。

1.3.2 游離氨基酸總量 采用茚三酮比色法[8]測定樣品中游離氨基酸的總量。以谷氨酸作為標準品，以谷氨酸含量為橫坐標(X)，以吸光度為縱坐標(Y)，獲得標準曲線方程為Y=2.701X-0.0664(R2=0.9945)。取1 mL樣品溶液至試管中，加入0.5 mL pH 8.0磷酸緩沖液，再加入0.5 mL 2 %茚三酮溶液。沸水中加熱15 min。冷卻后加水定容至25 mL。在570 nm處測定吸光度。根據標準曲線方程計算樣品中游離氨基酸的總量。

1.3.3 可溶性多糖含量 采用蒽酮-硫酸法[9]測辣木中可溶性多糖的含量。以葡聚糖作為標準品，以葡聚糖含量為橫坐標(X)，以吸光度為縱坐標(Y)，獲得標準曲線方程為Y=9.4202X-0.0131(R2=0.9979)。取樣品溶液100 μl，加蒸餾水定容至1 mL，加入2 g/L蒽酮硫酸溶液4 mL，沸水浴10 min。冷卻后于625 nm處測定吸光度。根據標準曲線方程計算樣品中可溶性多糖的總量。

1.3.4 多酚含量 參照姚文華等報道的福林酚法[10]測辣木中多酚的含量。以沒食子酸作為標準品，以其質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，得到標準曲線方程為Y=0.0011X+0.0013(R2=0.9995)。取10 mg/mL醇溶樣品，加水稀釋100倍。取1 mL稀釋液，加入2 mL 2 %的NaHCO3溶液，1 mL福林酚溶液，于765 nm處測定吸光度。根據標準曲線方程計算樣品中多酚的總量。

1.4 酶活力計算

1.4.1 蛋白酶的活力 參照GB/T 23527-2009蛋白酶制劑方法[11]測定樣品中的蛋白酶活力。以酪氨酸作為標準品，以其質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，得到標準曲線方程為Y=0.0085X+0.0141(R2=0.9991)。辣木葉水提液1 mL，加入酪蛋白1 mL，40 ℃保溫10 min；加入0.4 M三氯乙酸2 mL終止反應，繼續保溫20 min，離心后往上清液中加0.4 M Na2CO3溶液5 mL，福林試劑1 mL，40 ℃保溫發色20 min，于660 nm處進行測定吸光度。根據標準曲線方程計算樣品中蛋白酶活力。

1.4.2 纖維素酶的活力 參照王琳等人的方法[12]測定樣品中的纖維素酶活力。以葡萄糖為標準品，以其質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，獲得標準曲線方程為Y=0.0582X+0.0067(R2=0.9998)。辣木葉水提液1 mL，0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液3 mL，50 ℃水浴糖化10 min。加入3, 5-二硝基水楊酸顯色液5 mL，沸水浴10 min；快速冷卻至室溫后，于550 nm處測定吸光度。根據標準曲線方程計算樣品中蛋白酶活力。

1.4.3 糖化酶的活力 采用3, 5-二硝基水楊酸法測定樣品中的糖化酶活力[13]。方法同1.4.2 纖維素酶活力測定的方法，不同之處只在于將底物0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液換為可溶性淀粉溶液。

1.5 抗氧化能力測定

1.5.1 DPPH自由基清除能力 根據Ullah等[14]的方法進行DPPH自由基清除能力的測定。將1 mL樣品加入到1 mL 0.2 mM DPPH溶液中，同時用乙醇代替樣品作為對照，于室溫下避光靜置30 min，于517 nm 處測定吸光度。

圖中字母相同表示無統計學差異,下同The same letter in figure above indicated no statistical difference. The same as below圖1 毛霉發酵辣木葉過程中可溶性蛋白質含量變化Fig.1 Changes of soluble protein content in the process of fermenting Moringa leaves by Mucor

DPPH自由基清除率(%)=[(A對照-A樣品)/A對照]×100

式中，A樣品為待測樣品的吸光度；A對照為對照的吸光度。

1.5.2 ABTS·+自由基清除能力 參照孫丹等的方法[15]進行ABTS·+自由基清除能力的測定。將7 mM ABTS溶液和2.45 mM過硫酸鉀等體積混合，室溫避光放置12 h，生成ABTS·+母液。使用前將母液稀釋，使其在734 nm處吸光度為0.70±0.02，即為ABTS·+工作液。將20 μl待測樣品(以無水乙醇代替樣品作為對照)加入2 mL ABTS·+工作液中，混勻后避光靜置5 min，于734 nm處測定吸光度。ABTS·+自由基清除率計算公式同上述DPPH自由基清除率公式。

1.6 數據統計

通過SPSS 19.0軟件對數據統計分析。對不同時間點的各組數據采用單因素方差分析 (One Way ANOVA) 方法進行統計分析，各組均值之間的兩兩比較采用Duncan多重比較法。

2 結果與分析

2.1 辣木葉毛霉固態發酵過程中主要營養成分的變化

2.1.1 不同發酵時間辣木葉中可溶性蛋白質的變化 由圖1可知，在發酵過程中，辣木葉中的可溶性蛋白質含量呈現先升高后降低的趨勢。經發酵的辣木葉中可溶性蛋白質含量均顯著高于未發酵的(P<0.05)。發酵前辣木葉中可溶性蛋白質含量僅為56.5 mg/g；發酵6 d時，其含量達到最高(88.6 mg/g)，之后逐漸降低，發酵15 d時，含量為70.6 mg/g。

2.1.2 不同發酵時間辣木葉中游離氨基酸總量的變化 由圖2可知，在毛霉發酵過程中，辣木葉中的游離氨基酸總量持續增加。發酵前辣木葉中游離氨基酸總量僅為22.28 %，之后一直顯著增加(P<0.05)，發酵12 d時其含量增加到34.27 %，之后增加趨于平緩。

圖2 毛霉發酵辣木葉過程中游離氨基酸總量的變化Fig.2 Changes of total free amino acids in the process of fermenting Moringa leaves by Mucor

2.1.3 不同發酵時間辣木葉中可溶性多糖含量的變化 由圖3可知，在發酵過程中，辣木葉中可溶性多糖的含量總體呈現先增加后降低的趨勢。在初始發酵的3 d內，辣木葉中的可溶性多糖含量無顯著的變化；6 d時急劇上升至最高，為52.13 mg/g；之后逐漸降低，15 d時降至41.05 mg/g。

2.1.4 不同發酵時間辣木葉中多酚含量的變化 由圖4可知，辣木葉中多酚含量豐富。經毛霉發酵后，可顯著增加辣木葉中多酚的含量(P<0.05)。發酵9 d時，多酚含量為發酵前的2.83倍；12 d時略有下降，但無統計學差異；15 d時多酚含量為531.63 mg沒食子酸當量/100 g，是發酵前的2.25倍。

2.2 辣木葉毛霉固態發酵過程中相關酶活力的變化

2.2.1 不同發酵時間辣木葉中蛋白酶活力的變化 蛋白酶能催化蛋白質和多肽水解。由圖5可知，發酵前，辣木葉中蛋白酶活力為10.43 U/g，3 d后蛋白酶活力急劇上升至58.67 U/g；隨后6和9 d時蛋白酶活力趨于穩定，未表現出顯著性差異；12和15 d時該酶活力分別降低至28.23和24.63 U/g。

圖4 毛霉發酵辣木葉過程多酚含量的變化Fig.4 Changes of polyphenol content in the process of fermenting Moringa leaves by Mucor

圖5 毛霉發酵辣木葉過程中蛋白酶活力的變化Fig.5 Changes of protease activity in the process of fermenting Moringa leaves by Mucor

2.2.2 不同發酵時間辣木葉中纖維素酶活力的變化 纖維素酶能降解纖維素生成葡萄糖。由圖6可知，毛霉發酵辣木葉過程中，纖維素酶活力呈現先上升后下降的趨勢。發酵前，辣木葉中纖維素酶活力僅為5.24 U/g，發酵起始階段其活力緩慢上升；發酵9 d時纖維素酶活力達到最高(155.49 U/g)，是發酵前的29.67倍；12和15 d時該酶活力分別降至134.37和94.07 U/g。

2.2.3 不同發酵時間辣木葉中糖化酶活力的變化 由圖7可知，發酵前，辣木葉中蛋白酶活力為11 U/g，3 d后蛋白酶活力急劇上升至40.15 U/g；隨后糖化酶活力逐漸降低，發酵15 d時該酶活力與發酵前無統計學差異。

圖6 毛霉發酵辣木葉過程中纖維素酶活力的變化Fig.6 Changes of cellulase activity in the process of fermenting Moringa leaves by Mucor

圖7 毛霉發酵辣木葉過程中糖化酶活力的變化Fig.7 Changes of saccharifying enzyme activity in the process of fermenting Moringa leaves by Mucor

圖8 毛霉發酵辣木葉過程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.8 Changes of DPPH free radical scavenging ability in the process of fermenting Moringa leaves by Mucor

2.3 辣木葉毛霉固態發酵過程中抗氧化活性的變化

2.3.1 不同發酵時間辣木葉中DPPH自由基清除能力的變化 DPPH是一種常用于體外抗氧化活性評價的穩定的氮中心自由基。如圖8所示，毛霉發酵辣木葉過程中，在前9 d，辣木葉的DPPH自由基清除活性隨著發酵時間的延長顯著增加(P<0.05)，9 d時達到76.46 %，是發酵前的1.67倍。12和15 d時DPPH自由基清除能力略有下降，但與9 d時相比，無統計學差異。

2.3.2 不同發酵時間辣木葉中ABTS·+自由基清除能力的變化 本研究同時采用了ABTS·+自由基清除能力來評價辣木葉經毛霉發酵后的抗氧化活性。如圖9所示，辣木葉發酵過程中ABTS·+自由基清除能力與上述DPPH自由基清除能力趨勢相同，即辣木葉的ABTS·+自由基清除活性隨著發酵時間的延長顯著增加(P<0.05)，9 d后增加趨于平緩。發酵結束時ABTS·+自由基清除能力是發酵前的1.9倍。

3 討 論

3.1 毛霉發酵辣木葉過程中主要營養成分的變化

在毛霉發酵過程中，辣木葉中可溶性蛋白的含量呈現先升高后降低的趨勢，而游離氨基酸總量則隨發酵時間的延長而增加。此結果與管瑛等人[3]的研究結果一致，他們采用米根霉和少根根霉對豆渣進行發酵，也發現發酵過程中可溶性蛋白質呈現先增加后減少的趨勢。分析原因主要是因為發酵菌株魯氏毛霉產生蛋白酶，辣木葉中的蛋白質被蛋白酶逐漸分解成小分子蛋白質和多肽，增加了蛋白質的溶解性，所以可溶性蛋白質的含量會增加。隨著發酵時間的延長，辣木葉中的蛋白質繼續被降解成氨基酸，由于考馬斯亮藍法主要測定的是大分子的可溶性蛋白質，無法測定到其中的氨基酸，因此造成發酵后期可溶性蛋白質下降，而游離氨基酸總量隨發酵時間的延長而增加。

圖9 毛霉發酵辣木葉過程中ABTS·+自由基清除能力的變化Fig.9 Changes of ABTS·+ radical scavenging ability the process of fermenting Moringa leaves by Mucor

本研究中，辣木葉的可溶性多糖含量呈現先增加后降低的趨勢。辣木葉中富含纖維素，毛霉發酵辣木過程中，毛霉產生了纖維素酶，可將辣木中非水溶性的碳水化合物纖維素分解為水溶性的多糖，從而使辣木葉中的多糖含量得到提高。有研究表明，用木霉和酵母菌發酵普洱茶，其多糖含量隨發酵時間的延長而增加[16]。本研究中，發酵6 d后辣木葉中的多糖含量逐漸降低，這可能是由于毛霉繼續生長，將多糖作為碳源消耗掉。

在發酵過程中，辣木葉中的多酚含量也呈現先增加后降低的趨勢。這與唐仕榮等[17]對大蒜進行發酵加工的結果一致。多酚分為游離性多酚和結合態多酚，結合態多酚通常共價作用與細胞壁成分如纖維素、半纖維素、木質素、蛋白質等結合在一起。在本研究中，發酵前期，在纖維素酶、蛋白酶等酶的作用下，辣木葉中的結合態多酚被分解釋放，導致發酵產物中多酚含量增加。發酵后期，可能由于多酚的氧化或被分解，導致發酵產物中多酚含量減少。

3.2 毛霉發酵辣木葉過程中相關酶的酶活變化

而毛霉在自然界中分布很廣，能產生蛋白酶，具有分解大豆蛋白的能力，因此常用來制作腐乳、豆豉等。魯氏毛霉還能產生豐富纖維素酶，具有很強的分解纖維素的能力。在本研究中，辣木葉中的蛋白酶、纖維素酶、糖化酶的活力在發酵過程中均呈現先升高后降低的趨勢。這與豆渣發酵過程中這3種酶的酶活變化趨勢一致[3]。原因可能是，辣木葉具有高蛋白、高纖維的特點；發酵前期，毛霉生長迅速，產生大量蛋白酶、纖維素酶和糖化酶以分解辣木葉中的蛋白質和纖維素；而發酵后期，隨著底物的減少，相關酶的活力逐漸降低。

3.3 毛霉發酵辣木葉過程中抗氧化活性的變化

抗氧化是抗氧化自由基的簡稱。自由基對人體危害極大，它們可以在體內肆意掠奪其它物質的電子，使自己形成穩定的物質，從而破壞蛋白質、DNA、RNA等，使體內細胞、組織、器官功能降低，從而導致衰老、心血管疾病、腫瘤等各種疾病的發生[18]。因此，尋找外源性的自由基清除劑(即抗氧化劑)成為當前研究的熱點。研究表明，一些植物成分或微生物發酵產物具有較強的清除體內自由基的作用及抗氧化作用[19-20]。

DPPH自由基是一種以氮為中心的穩定的自由基。通過對樣品中DPPH自由基的清除能力的檢測可以反映其抗氧化能力的強弱。ABTS，即2,2'-聯氨-雙 (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二胺鹽，當氧化作用發生時會被氧化成綠色的ABTS+。樣品中ABTS·+的產生被抑制則說明該樣品具有抗氧化物存在。本研究通過DPPH、ABTS 2種自由基清除能力來評價辣木毛霉發酵物的抗氧化能力。本研究的結果表明，DPPH自由基清除能力和ABTS·+自由基清除能力均隨發酵時間的延長而增加，但9 d之后增加趨于平緩。一些研究結果與本研究相似，韓雪等人[21]以植物乳桿菌發酵紅棗漿，發酵后DPPH自由基清除能力增加了139.3 %。管瑛等人[3]利用米根霉、少孢根霉發酵豆渣，在發酵0～18 h內，隨著發酵時間的延長，豆渣的ABTS·+清除活性顯著上升，18 h后發酵豆渣的ABTS·+清除活性趨于穩定。毛霉發酵辣木葉的過程中，發酵產物的種類和含量不斷發生變化，因此捕獲自由基的能力即抗氧化能力也隨之發生變化。

4 結 論

本研究以辣木葉粉為原料，以魯氏毛霉為發酵菌株，進行辣木葉粉固態發酵。結果表明，毛霉發酵后辣木葉中可溶性蛋白、可溶性多糖、多酚的含量及蛋白酶、纖維素酶、糖化酶的活力均呈現先增加后減少的趨勢。游離氨基酸總量、DPPH和ABTS·+清除能力均隨發酵時間的延長顯著增加，9 d后增加趨于平緩。本研究結果表明毛霉發酵辣木葉后提高了辣木葉的營養價值和抗氧化能力。本研究為利用辣木葉開發功能性食品或配料提供理論參考。