水楊酸受體NPR1負調控枝頂孢霉Acremonium sp. D212與宿主植物共生

韓 麗，周 璇，平翔蕊，何云露，趙宜婷，武麗霞，張利娜，姜 茜，錢 杰，彭 晟，何霞紅，杜云龍*

(1.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201； 2.云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南農業大學，云南 昆明 650201；3.云南農業大學農業生物多樣性與病害控制教育部重點實驗室，云南 昆明 650201)

【研究意義】內生真菌對植物生長發育起到重要作用。開展內生真菌與植物共生的研究，對于揭示內生真菌與植物相互作用的機制、促進農業生產具有重要的理論意義及應用價值。【前人研究進展】內生真菌通過和宿主植物共生的方式生活于正常的植物組織中，不引起植物明顯的感染癥狀。目前，從云南三七上已分離到多株內生真菌，一些內生真菌表現出對三七根腐病病原真菌的生長有抑制作用[1-2]。植物激素獨腳金內酯[3]和生長素[4]等激素在真菌與植物共生中起到重要的作用。枝頂孢屬真菌是一類具有重要經濟價值的真菌，目前，已從許多藥用植物如黃芩[5]和蟲草[6]中分離得到，大多數情況下，它們都表現為優勢菌群。枝頂孢霉在患根腐病人參的根際土壤中已成為常見真菌[7-8]。枝頂孢霉具有許多重要的功能，其次生代謝產物具有抗微生物活性[9]。枝頂孢霉的激發子AsES在觸發擬南芥防御反應時與水楊酸、茉莉酸及乙烯途徑有關[10]。水楊酸作為一類重要的植物激素，它可通過抑制生長素的運輸而調節水稻根系的發育[11]。【本研究切入點】植物激素水楊酸在調控枝頂孢霉與植物共生中的作用機制還很不清楚。 【擬解決的關鍵問題】揭示水楊酸受體與枝頂孢霉相互作用調控植物發育的機制。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

水稻水楊酸受體突變體OsNPR1-RNAi及野生型TP309由中科院植物生理生態研究所何祖華研究員提供，枝頂孢霉菌株(Acremoniumsp. D212，簡稱D212)為實驗室分離保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 D212接種三七 在超凈工作臺內，用接種針挑取D212菌絲，接種到距離三七組培苗根部2～3 mm處，28 ℃共同培養14 d。

1.2.2 三七轉錄組分析 D212接種三七組培苗14 d后，提取總RNA，用HiSeq對樣品進行高通量測序，進行序列組裝，獲得Unigene庫，分析Unigene的表達量和功能富集。由北京百邁客公司進行轉錄組測序及分析。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析三七基因表達量 使用EasyPurePlant RNA Kit(ER301, Transgen)試劑盒提取三七總RNA，One-Step gDNA Removel for qPCR(AT341，Transgen)試劑盒逆轉錄合成cDNA。實時熒光定量PCR (Real-time PCR)反應體系包括5 μl含有Power UpTMSYBRTMGreen 染料的反應混合物(Thermo Fisher Scientific, China)，0.42 ng cDNA，0.4 μl基因特異引物，滅菌 ddH2O補足10 μl體系。PCR反應程序為：95 ℃預變性30 s；40個循環的95 ℃變性45 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。18SrRNA(GenBank: D85171)和actin7(AK060893)作為內參基因， 2-ΔΔCt計算表達量。基因特異性引物(表1)用于擴增18SrRNA和OsActin7、PnNPR1、PnPR2、PnPR10、PnDAD2d、PnD14c、PnD27基因，并用SPSS 19.0 軟件(IBM, Inc., Armonk, NY, USA)分析表達差異，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

表1 基因特異引物序列

1.2.4 D212在水稻根中的定殖 水稻種子滅菌后，在MS培養基中培養5 d，挑取D212菌絲接種在水稻根周圍，28 ℃共培養7 d后，用與抗體Alexa FluorTM488結合的小麥胚芽凝集素(Wheat Germ Agglutinin,Alexa FluorTM488 Conjugate，簡稱WGA，W11261, Invitrogen，USA)進行免疫反應[12]，用Leica SP 5激光共聚焦顯微鏡觀察真菌在根中的定殖。CTAB法提取水稻根的DNA，real-time PCR檢測D212在水稻根中的定殖量，用Ac 2-1-2 rFP與Ac 2-1-2 rRP引物(表1)擴增D212核糖體DNA的部分Internal transcribed spacer(ITS)片段。

1.2.5 水稻根尖免疫組化 D212接種于水稻根并共同培養7 d后，取0.5 cm 的水稻胚根根尖進行免疫組化實驗[13]。其中，一抗為抗兔的OsPIN1多克隆抗體(Anti-rabbit OsPIN1 polyclonal antibody)及抗兔的OsPIN2多克隆抗體(Anti-rabbit OsPIN2 polyclonal antibody)，1∶200倍稀釋，二抗為與抗體Alexa fluor 488偶聯的驢抗兔IgG (H+L)抗體(Donkey Anti-rabbit IgG (H+L)-Alexafluor 488 coupled antibody, 713-545-003, Jackson ImmunoResearch)，1∶500倍稀釋。使用ImageJ 1.41軟件測量OsPIN1及OsPIN2蛋白的熒光強度。

2 結果與分析

2.1 枝頂孢霉D212與三七共生情況

枝頂孢霉D212是從三七中分離出來的內生真菌。為了研究D212在植物發育中的作用，將D212接種三七組培苗，共培養14 d后，與未接菌的三七相比(圖1A)，接種D212的三七能正常的生長(圖1B)，D212沒有對三七產生明顯的病害作用。

2.2 三七中差異表達基因的富集分析

為了進一步分析D212與三七共生時的基因表達量，D212接種三七14 d后，對三七組培苗開展轉錄組分析。對差異表達基因進行GO(Gene Ontology)富集分析發現，D212與三七共生時，共有61 005條基因得到歸類注釋，涉及生物學過程(Biological processes, BP)、細胞組分(Cellular components, CC)及分子功能(Molecular functions, MF)3大類共54個小類(圖2)。在BP分類中，單有機體過程類別(Single-organism process)所占比例最多，其次為發育過程類別(Developmental process)及生殖過程(Reproductive process)。在CC分類中，細胞器類別(Organelle)所占比例最多，其次為膜類別(Membrane)及細胞連接類別(Cell junction)。在MF分類中，核酸結合轉錄因子活性類別(Nucleic acid binding transcription factor activity)所占比例最多，其次為分子轉導活性類別(Molecular transducer activity)(表2)。

2.3 枝頂孢霉D212降低了三七中獨腳金內酯相關基因的表達

在D212與三七共生中，轉錄組分析顯示與發育過程相關基因的表達受到顯著影響。植物激素參與調節植物發育，獨腳金內酯在植物與真菌的共生中起到重要作用[3]。在D212與三七組培苗共培養14 d后，通過real-time PCR檢測三七組培苗中獨腳金內酯相關基因的表達量，發現三七中與獨腳金內酯合成(PnD27)及信號途徑相關的基因(PnDAD2d，PnD14c)的表達量都顯著降低(圖3)。這暗示獨腳金內酯在D212與三七共生中未起到顯著作用。

A: 未接種D212；B: 接種D212A: Uninoculated with Acremonium sp. D212; B: Inoculated with Acremonium sp. D212圖1 三七苗表型Fig.1 Phenotype of P. notoginseng seedling

圖2 三七轉錄組GO 分類注釋Fig.2 GO classification annotation in transcriptome data of P. notoginseng

2.4 三七中防御相關基因的表達

因為D212沒有引起三七明顯的病癥(圖1)。進一步研究三七中相關防御基因的表達水平。D212與三七共生后，轉錄組數據顯示，編碼病程相關蛋白的基因大量表達，其次為水楊酸相關蛋白、脫落酸及乙烯相關蛋白(圖4)。對表達病程相關蛋白中的10個unigene分析發現，這10個unigene的表達水平沒有明顯上調(圖5)，對PnPR2及PnPR10進行real-time PCR檢測發現，PnPR10基因的表達明顯下調，PnPR2基因的表達沒發生明顯變化(圖6)。但是，編碼水楊酸受體PnNPR1的表達水平明顯升高(圖6)。這顯示D212在與三七共生時可激活水楊酸信號通路相關基因的表達，但并未引起宿主的防御反應。

2.5 枝頂孢霉D212與水稻共生情況

為了進一步揭示D212與宿主植物的共生機制，將D212接種于水楊酸受體突變體OsNPR1-RNAi及其野生型TP309的水稻根。用WGA對D212進行免疫染色觀察，發現D212可以定殖于水稻根表皮(圖7B、圖7D)。Real-time PCR擴增水稻根中D212的部分ITS序列，發現在突變體OsNPR1-RNAi水稻中，D212的定殖量顯著高于野生型TP309(圖8)。當D212與水稻組培苗共培養7 d后，與野生型TP309相比，D212的處理使突變體OsNPRI-RNAi的根顯著變長(圖9～10)。上述結果顯示，水楊酸受體NPR1負調控枝頂孢霉D212與宿主植物的共生。

表2 GO功能注釋分析差異表達基因

** 表示P<0.01。PN:未接種D212的三七；PNF: 接種D212的三七，下同**meant P<0.01. PN: P. notoginseng uninoculated with Acremonium sp. D212; PNF: P. notoginseng inoculated with Acremonium sp. D212. The same as below圖3 三七中獨腳金內酯相關基因表達量Fig.3 The expression levels of strigolactone-related genes in P. notoginseng

2.6 枝頂孢霉D212降低水稻根中生長素輸出蛋白的膜定位

為了檢測D212調控水稻根系發育是否與生長素的極性運輸受到影響有關，進一步檢測了突變體OsNPR1-RNAi及野生型TP309根尖中生長素輸出蛋白OsPIN1與OsPIN2的細胞定位。結果顯示，在野生型TP309中，生長素輸出蛋白OsPIN1及OsPIN2的細胞定位沒有發生改變，但在OsNPR1-RNAi突變體中細胞定位顯著減弱(圖11～12)。這顯示D212通過改變生長素輸出蛋白OsPIN1及OsPIN2的細胞定位而調節生長素的極性運輸，從而調控水稻的根系發育。

圖5 三七中PnPR2與PnPR10基因熱圖Fig.5 Heat map of PnPR2 and PnPR10 genes in P. notoginseng

3 討 論

植物激素參與調控內生真菌與植物的共生。研究發現枝頂孢霉D212與三七共生時，沒有引起三七的防御反應。但D212可以在水稻的水楊酸信號突變體OsNPR1-RNAi中大量定殖并促進水稻根系生長。顯示了水楊酸在枝頂孢霉D212與宿主植物共生中的重要作用。

在已知的植物激素中，獨腳金內酯在叢枝菌根共生中可作為根際土壤信號[14]，植物的獨腳金內酯受體對于叢枝菌根的發育是必需的[3]。但是，在D212與三七共生時，三七中獨腳金內酯的信號及合成相關基因的表達水平都降低，顯示三七并沒有分泌更多的獨腳金內酯來促進三七與D212的共生，或獨腳金內酯并不是三七與D212共生中的關鍵激素。

圖4 三七中病程防御相關基因的比例Fig.4 Percentage of pathogenesis-related genes in P. notoginseng

圖6 三七中PnPR2、PnPR10及PnNPR1基因的表達量Fig.6 The relative expression levels of PnPR2, PnPR10 and PnNPR1 in P. notoginseng

內生真菌在植物中的定殖產生了屏障效應，從而使內生真菌在植物防御機制中起到重要作用[15]。已有研究發現，內生真菌印度梨形孢在明顯減輕真菌大麗輪枝菌引起的擬南芥病害時，并沒有激活宿主防御基因的表達[12]。目前，已從枝頂孢霉中發現與植物防御反應有關的基因[16]。植物激素在內生真菌與植物共生時發揮重要作用[17]。D212與三七的共生激活了水楊酸信號途徑中NPR1基因的表達，但是，我們并沒有看到病程防御基因上調表達(圖5～6)，而D212也沒有引起三七明顯的病害反應(圖1B)。在D212與水稻共生時，當水楊酸受體NPR1基因發生突變促進了D212與水稻的共生，顯示水楊酸信號途徑引起的防御反應受到抑制有利于D212與植物的共生，顯示其共生途徑與植物的抗病防御反應是2條不同的途徑。D212與水楊酸信號突變體OsNPR1-RNAi水稻共生，水稻中生長素輸出蛋白OsPIN1及OsPIN2的細胞定位顯著減弱(圖11～12)。生長素輸出蛋白調節了生長素的極性分布[18-19]。顯示D212與植物共生改變生長素運輸促進了植物的發育。

* 表示P<0.05* meant P<0.05圖8 D212在水稻根中的ITS基因表達Fig.8 The expression level of ITS gene of Acremonium sp. D212 in rice root

A: 水稻TP309；B: 水稻TP309接種D212；C:水稻OsNPR1-RNAi；D:水稻OsNPR1-RNAi接種D212；箭頭所示為D212菌絲；標尺: 10 μmA: Rice TP309；B: Rice TP309 inoculated with Acremonium sp. D212；C: Rice OsNPR1-RNAi； D: Rice OsNPR1-RNAi inoculated with Acremonium sp. D212；The arrow shows hyphae of Acremonium sp. D212; bar: 10 μm圖7 枝頂孢霉D212在水稻根中的定殖Fig.7 The colonization of Acremonium sp. D212 in rice root

A:水稻TP309；B:水稻TP309接種D212；C:水稻OsNPR1-RNAi；D:水稻OsNPR1-RNAi接種D212；標尺: 1 cmA:Rice TP309；B: Rice TP309 inoculated with Acremonium sp. D212；C: Rice OsNPR1-RNAi；D: Rice OsNPR1-RNAi inoculated with Acremonium sp. D212；bar: 1 cm圖9 水稻根表型Fig.9 Rice root phenotype

CK：未接種D212的水稻；D212：接種D212的水稻；下同CK: Rice uninoculated with Acremonium sp. D212; D212: Rice inoculated with Acremonium sp. D212; The same was below圖10 水稻根長Fig.10 The root length of rice

圖11 水稻根表皮細胞中OsPIN1與OsPIN2的熒光強度Fig.11 The fluorescence intensity of OsPIN1 and OsPIN2 in rice root epidermal cells

A：水稻TP309中OsPIN1的細胞定位；B：水稻TP309接種D212后OsPIN1的細胞定位；C：水稻OsNPR1-RNAi中OsPIN1的細胞定位；D：水稻OsNPR1-RNAi接種D212后OsPIN1的細胞定位; E：水稻TP309中OsPIN2的細胞定位；F：水稻TP309接種D212后OsPIN2的細胞定位；G：水稻OsNPR1-RNAi中OsPIN2的細胞定位；H：水稻OsNPR1-RNAi接種D212后OsPIN2的細胞定位；OsPIN1-AB：抗OsPIN1蛋白抗體；OsPIN2-AB：抗OsPIN2蛋白抗體；標尺：10 μm圖12 水稻根表皮細胞中OsPIN1與OsPIN2的細胞定位 Fig.12 The cellular localization of OsPIN1 and OsPIN2 in rice root epidermal cells

4 結 論

研究結果顯示，枝頂孢霉D212與宿主植物的共生需要抑制水楊酸受體NPR1介導的防御反應，并通過改變生長素的運輸調節根系的生長。