基于黃褐棉導入系的棉花衣分QTL定位研究

陳 奇，周水娟，孫康泰，劉 靜，袁寶童，王議萍，王 為，王有武，汪保華，莊智敏*

(1.南通大學生命科學學院，江蘇 南通 226019；2.江蘇沿海地區農業科學研究所，江蘇 鹽城 224002；3.塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

【研究意義】棉花是世界上首選的也是最重要的紡織纖維原材料，其產量的提高對推動世界經濟和紡織工業的發展起著重要作用，進而可有力地改善了人民生活水平。籽棉產量和皮棉產量是棉花產量的兩種主要衡量指標，而單株鈴數、單鈴重、衣分則是皮棉產量的三個主要組成要素，其中衣分在產量育種的選擇中占據重要地位[1]，在各因素中具有最高的遺傳率[2]。因此，定位棉花中衣分相關的數量性狀位點，可對棉花的產量研究做出貢獻。【前人研究進展】近年來，分子標記輔助育種(Molecular Marker Assisted Selection，MAS)技術不斷發展，已廣泛應用于各種種質研究中，并將發揮出越來越大的作用[3]。SSR分子標記是最常用的分子標記技術之一，而且它已經被用于棉花育種許多年，并取得了許多成果，通過構建相關遺傳圖譜，在DNA水平上對相應數量性狀基因座(Quantitative Trait Locus, QTL)的數目、位置、效應以及QTL與QTL間、QTL與環境的互作、QTL的一因多效性等展開研究，結合表型性狀能直觀反應作物的遺傳多樣性[4]。導入系(Introgression lines，ILs)，又稱染色體片段代換系(Chromosome segments substitution lines)，可簡要理解為用供體親本的染色體片段去替換受體親本的相應位置片段[5]，該過程可通過自交和回交相結合的方式來構建目的群體。染色體片段導入系可以定向改良棉花產量性狀，其關鍵在于能對復雜的產量性狀進行定位。迄今為止，研究者已在包括水稻、玉米、番茄、油菜等一些作物的染色體片段導入系中進行過QTL詳細定位研究[6-10]。而所謂的QTL定位，就是定位基因在染色體上的位置。為了棉花的基因組研究和分子育種，早在十多年前，國外就已經開展了QTL定位在棉花育種中的研究，許多研究團隊已經繪制過產量和產量構成因子性狀的QTL[11]。石玉真等[12]利用主效纖維QTL的分子標記輔助選擇明顯地改善了棉花纖維強度，加快了棉花纖維品質的育種進程。然而，他們使用的絕大多數分離群體是暫時性群體，由于低遺傳性和高實驗誤差是影響數量性狀鑒定的主要因素，構建永久性的群體來解決這些問題是一種有效的方法。重組自交系(RILs)群體以及導入系群永久性群體在植物育種和遺傳研究中非常有用[13-14]。【本研究切入點】四倍體棉花栽培種主要有2個：陸地棉(GossypiumhirsutumL.)以及海島棉(GossypiumbarbadenseL.)，其中陸地棉是更為廣泛的栽培棉[15-16]。黃褐棉是起源于巴西的四倍體野生棉，與陸地棉遺傳距離相距甚遠，必然具備一些新的有用的基因位點，若能將其導入到陸地棉中，可能會對栽培品種的改良有重要意義。Tanksley和Nelson提出的回交高世代QTL(Advanced backcross QTL，AB-QTL)分析法可將野生種的優良主效基因導入到常規栽培種中，并能很好地解決在引入有利基因時產生的連鎖累贅問題[17]。【擬解決的關鍵問題】本研究擬利用野生棉資源來拓寬陸地棉遺傳多樣性，以黃褐棉與陸地棉雜交并回交構建的導入系群體為材料，開展SSR分子標記實驗，結合衣分表型性狀調查，鑒定衣分QTL，以期服務于后續的棉花分子育種。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗以常規栽培棉陸地棉PD94042為受體親本(P1)，以野生棉黃褐棉(G.mustelinum)為供體親本(P2)雜交，雜交后代與陸地棉輪回親本回交，通過多次回交構建出高世代回交群體[18]。從中選育出一套滲透有黃褐棉染色體片段的導入系群體(共計65份材料)并置于2個環境(2011與2012年)下進行重復實驗。

1.2 實驗方法

本次研究中的棉花葉片DNA的提取采用CTAB法[19]，并根據具體情況作了相應的改良，提取后的DNA采用1 %的瓊脂糖電泳檢測其濃度及分子量，或者使用紫外分光光度計檢測DNA的純度與濃度，OD260/OD280值在1.7～1.9 范圍內為合適。SSR分子標記包括PCR反應體系的建立和擴增、產物的分離、基因型的分析等步驟。實驗過程中標記出并記錄所得數據。

1.3 數據統計及分析

實驗通過聚丙烯酰胺凝膠電泳來進行群體基因型統計，根據清楚的顯示條帶結果，然后依據DNA Ladder標準，記錄所用SSR標記的類型，將每個引物所標記的數據輸入Excel表格。在整個實驗過程中仔細記錄各個時間段的田間表型數據，輸入Excel表格，并進行相應的統計分析，計算其衣分相關值，包括平均值、范圍、變異系數、偏度等，并制作柱狀分布圖。

綜合導入系群體的基因型數據，用MAPMAKER/EXP 3.0軟件分析各標記之間的連鎖關系，選用Kosambi函數，LOD值設為3，最大交換距離為40 cM，構建分子標記的遺傳連鎖圖譜；結合田間表型數據，利用WinQTLCart2.5軟件開展基于黃褐棉導入系的衣分QTL定位，檢測QTL最低LOD值為3。

2 結果與分析

2.1 衣分表型分析

如表1所示，2011年的衣分(LP11)平均值為34.88，親本衣分小于群體平均值；導入系群體的衣分變化范圍是17.58～41.60，數據變異程度不是很高，但偏度絕對值較高。2012年的衣分(LP12)平均值為36.23，親本衣分大于群體平均值；導入系群體的衣分變化范圍是18.98～41.81，數據變異程度較大，偏度絕對值較高。

表1 黃褐棉導入系群體衣分統計分析

圖1 導入系群體衣分表型分布Fig.1 Phenotypic distribution of lint percentage in the IL population

導入系群體的衣分分布如圖1所示，根據結果統計可以看出該導入系群體中存在來自于黃褐棉的與衣分相關的漸滲片段，對群體衣分的提高具有一定的促進作用。

2.2 遺傳連鎖圖與衣分QTL分析

綜合導入系群體的表型數據和基因型數據，構建衣分性狀的遺傳連鎖圖譜。本實驗采用復合區間作圖，檢測某一特定的標記區間，將該特定標記與其他QTL連鎖的標記也擬合在模型中，控制背景遺傳效應[20]。

由表2可以看出，共檢測到21個衣分QTLs，它們的LOD值均大于3；解釋的表型方差從19.3 %(qLP-2-1)到42 %(qLP-19-1)。根據加性效應可知，共有9個QTL，即qLP-2-1、qLP-3-1、qLP-5-1、qLP-11-2、qLP-19-1、qLP-19-2、qLP-22-1、qLP-23-1、qLP-26-1的衣分增效基因來自于黃褐棉。位于3號染色體上的qLP-3-1在兩個環境下都能檢測到；5號染色體上的qLP-5-1、11號染色體上的qLP-11-2以及位于19號染色體上的qLP-19-1，它們的LOD值大于7；這4個QTL的衣分增效基因均來自黃褐棉，即黃褐棉具有提高衣分的作用，有必要進一步開展深入研究，可以作為后續精細定位以及優良導入系選擇基礎的重點內容。

表2 導入系群體衣分QTL定位結果

3 討 論

作物的大部分農藝性狀由多基因控制，但每個基因只能表現出微效的作用，而且環境對作物表型的影響相對較大，因此用傳統的育種方法進行性狀選擇會造成較大的偏差。隨著DNA分子標記技術在遺傳圖譜構建中的廣泛應用，許多研究者提出利用分子標記輔助選擇的方法來改良數量性狀，比利時人Peleman和vander Voort[21]在2003年提出構建大量的染色體片段導入系的分子設計新型育種方法，極大地推動了分子育種的進程。Kohel早在1977年就利用陸地棉TM-1、海島棉3-79雜交，培育了6個單片段代換系材料[22]。在作物中也報道了通過分子標記輔助選擇和高世代回交相結合的方法來獲得染色體漸滲片段，包括棉花[23]、大豆[24]、水稻[25]等。在前人的眾多研究中，極少有使用黃褐棉染色體片段漸滲系的報道，本研究使用野生棉黃褐棉作為親本材料之一，黃褐棉作為與陸地棉遺傳距離最遠的異源四倍體野生棉，很可能具備一些優異的基因位點，如能將其導入到栽培種陸地棉中，可對改良現有陸地棉栽培種做出重大貢獻。

衣分是棉花產量的重要組分之一，在陸地棉眾多的產量構成因子中具有最高的遺傳率，許多研究者都已做過大量研究。張建[26]等利用陸海重組自交系群體，共鑒定到12個影響衣分的QTL，解釋表型變異率為3.5 %～21.2 %。Guo等[27]利用陸地棉的重組自交系群體檢測到6個衣分相關的QTL。Li等[28]利用陸地棉組合F2:3群體檢測到1個衣分相關的QTL。孔廣超[29]等利用永久性陸地棉RIL群體在4種環境下共檢測到6個與衣分相關的、具有較高貢獻率的QTL。

本研究以黃褐棉染色體片段替換系為材料，在2011和2012兩個不同環境中，共鑒定到21個影響衣分的QTL，它們大多離散地分布在多條染色體上，解釋表型變異率為19.3 %～42 %，加性效應在4.75～6.40。同一性狀的QTL在不同定位群體中的表現不一致，同一群體的QTL檢測結果也會因環境等因素的不同而有差異；位于3號染色體上的QTLqLP-3-1在兩個環境中均檢測到，表現出不依賴于環境的穩定性。位于19號染色體上的qLP-19-1貢獻率高且LOD值最大，可以作為后續研究的重點內容，開展精細定位甚至圖位克隆。朱亞娟[30]等利用海島棉染色體片段導入系鑒定到位于15號染色體上的QTL，與所檢測到的qLP-15-1可能具有一定的關聯；同時，位于3號染色體上的QTLqLP-3-1與25號染色體上的qLP-25-1可能與Guo[29]等在同一條染色體上檢測到的衣分QTL通過共性標記建立聯系；Zhang[31]等利用基于陸地棉的重組自交系群體鑒定到位于5號染色體上的qLP-5-1和18號染色體上qLP-18-1，本研究中也有相應染色體的QTL。

4 結 論

本研究鑒定出的衣分 QTLs 大多都具有較高的貢獻率，在棉花產量的分子設計育種方面具有一定的應用前景。在接下來的研究中，可以用含有貢獻率較大QTL的導入系材料為供體親本，與陸地棉品種進行雜交與回交，開展精細定位，加快棉花產量的分子育種進程。