滇重樓野生品種與栽培品種核苷類成分質(zhì)量等同性研究

孟 瑩，王 騫,，周 濃，楊 敏，母茂君,，黃 瑜，田朝敬，李 楊

(1.大理大學藥學與化學學院，云南 大理 671000；2.重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 404120；3.三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120；4.大理大學學報編輯部，云南 大理 671003)

【研究意義】滇重樓為百合科重樓屬云南重樓的干燥根莖，是中藥重樓的重要來源之一[1]。具有清熱解毒、消腫止痛等功效，現(xiàn)代藥理學研究表明，重樓具有抗腫瘤、抗菌、抗炎和止血等作用[2]。重樓含有豐富的化學物質(zhì)，主要包括甾體皂苷類、黃酮類和核苷類等[3]。核苷是一類由含氮堿基與糖縮合而成的糖苷，是構成生命體DNA和RNA的基本物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗菌、抗血小板聚集等作用[4]，與重樓的生物活性具有一定的相關性，可作為重樓藥材質(zhì)量評價的重要指標。近年來，重樓藥材應用范圍不斷擴大，市場需求量逐年增加，供需矛盾日益突出[5]，僅靠自然資源已無法滿足市場需求，現(xiàn)階段種苗栽培技術日益成熟[6]，重樓仿野生種植規(guī)模不斷擴大，但栽培重樓與野生重樓是否具有質(zhì)量等同性尚無確切結論。【前人研究進展】周濃等[7]測定重樓屬植物中10種核苷和堿基，結果表明，核苷和堿基類成分的含量及組成結構比存在著較大差異，產(chǎn)地和品種是造成差異的主要因素。潘興嬌等[8]測定云南重樓根莖中9種核苷類成分的含量。結果表明，重樓核苷含量受產(chǎn)地、環(huán)境因素影響較大，品質(zhì)表現(xiàn)出一定的地域和生境依賴性。【本研究切入點】本實驗采用HPLC法對16批野生品種和17批栽培品種的9種核苷含量進行測定，通過聚類分析和主成分分析方法對其進行評價，以期全面、客觀評價栽培重樓的品質(zhì)。【擬解決的關鍵問題】以9種核苷成分含量為指標，對不同產(chǎn)地樣品進行質(zhì)量評價，探討栽培重樓是否與野生重樓具有質(zhì)量等同性，為擴大藥用資源提供科學依據(jù)。

表1 樣品來源信息

1 材料與方法

1.1 供試材料

高效液相色譜儀(日本島津集團)；多管架自動平衡離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)；分析天平(德國Sartorius公司)；超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。尿嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥99 %。甲醇為色譜純(德國默克公司)、水為娃哈哈純凈水。野生組樣品為課題組成員在相應地點采挖所得；栽培組樣品為野生滇重樓苗移栽至相應生境下，經(jīng)過土壤殺蟲、殺菌處理，施基肥、澆透定根水、噴施葉面肥等方法進行栽培后采挖所得，所有樣品經(jīng)重慶三峽學院周濃教授鑒定為百合科重樓屬植物云南重樓[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.]。留樣憑證存放于三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室(重慶三峽學院)。樣品來源信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Venusil MP C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～10 min，1 %～5 % A；10～15 min，5 %～15 % A；15～22 min，15 %～17 % A；22～26 min，17 %～20 % A；26～32 min，20 %～24 % A；32～50 min，24 %～1 % A；50～55 min，1 % A)。檢測波長：260 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μl；柱溫：35 ℃。

1.2.2 核苷對照品溶液的配制 分別精密稱取減壓干燥至恒重的尿嘧啶5.1 mg、胞苷6.4 mg、鳥嘌呤6.1 mg、尿苷31.7 mg、腺嘌呤6.2 mg、鳥苷9.8 mg、胸苷6.4 mg、腺苷57.2 mg、2′-脫氧腺苷5.1 mg，置于同一容量瓶中，加水、混勻、定容至10 mL，即得混合核苷對照品母液，其濃度分別為尿嘧啶0.51 mg/mL、胞苷0.64 mg/mL、鳥嘌呤0.61 mg/mL、尿苷3.17 mg/mL、腺嘌呤0.62 mg/mL、鳥苷0.98 mg/mL、胸苷0.64 mg/mL、腺苷5.72 mg/mL，2′-脫氧腺苷0.51 mg/mL。

1.2.3 滇重樓供試溶液的配制 精密稱取滇重樓粉末(過三號篩)1.0 g，置于10 mL離心管中，精密加水5 mL，混勻，在室溫條件下超聲(300 W，40 kHz)提取15 min，取出后以4000 r/min離心10 min，吸取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾即得。

1.2.4 線性關系考察 精密量取1.2.2所得混合核苷對照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，加水定容至10 mL，得到6個濃度梯度的混合核苷對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，其線性范圍見表2，分別在1.2.1色譜條件下進行測定，以各對照品峰面積(Y)與其相應濃度(X)進行線性回歸，線性關系考察結果見表2。

1.2.5 精密度試驗 取同一混合對照品溶液，在1.2.1色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄各核苷的色譜峰面積，結果顯示各核苷的峰面積RSD分別為1.40 %(尿嘧啶)、2.25 %(胞苷)、1.26 %(鳥嘌呤)、2.35 %(尿苷)、2.67 %(腺嘌呤)、2.89 %(鳥苷)、2.44 %(胸苷)、2.91 %(腺苷)、2.83 %(2′-脫氧腺苷)，表明儀器精密度良好。

1.2.6 重復性試驗 取滇重樓粉末(樣品Z 17)6份，精密稱定每份1.0 g，按1.2.3方法制備供試品溶液，在1.2.1色譜條件下進行測定，記錄各核苷的色譜峰面積，結果顯示各核苷的峰面積RSD分別為2.20 %(尿嘧啶)、2.20 %(胞苷)、1.11 %(鳥嘌呤)、2.88 %(尿苷)、2.80 %(腺嘌呤)、2.91 %(鳥苷)、1.04 %(胸苷)、1.01 %(腺苷)、2.96 %(2′-脫氧腺苷)，表明方法重復性良好。

表2 線性關系考察結果

1.2.7 穩(wěn)定性試驗 將滇重樓粉末(樣品Z17)供試液在室溫條件下密閉放置，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，記錄各核苷的色譜峰面積，結果顯示各核苷的峰面積RSD分別為2.42 %(尿嘧啶)、2.45 %(胞苷)、2.50 %(鳥嘌呤)、2.43 %(尿苷)、2.51 %(腺嘌呤)、2.97 %(鳥苷)、2.88 %(胸苷)、3.00 %(腺苷)、2.72 %(2′-脫氧腺苷)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的滇重樓粉末(樣品Z17)6份，精密稱定每份0.5 g，分別精密加入適量各核苷對照品溶液，按1.2.3方法制備供試品溶液，在1.2.1色譜條件下進樣，加樣回收率分別為0.97 %(尿嘧啶)、0.99 %(胞苷)、0.99 %(鳥嘌呤)、0.95 %(尿苷)、1.01 %(腺嘌呤)、1.04 %(鳥苷)、1.02 %(胸苷)、1.01 %(腺苷)、1.00 %(2′-脫氧腺苷)，RSD均小于3.00 %，表明上述實驗方法準確度較高。

2 結果與分析

2.1 核苷類成分色譜圖

按1.2.1色譜條件進行分析，所得到的色譜圖如圖1所示。9種核苷成分分離度較好，其中圖1A為按1.2.2方法制備的混合核苷對照品色譜圖，圖1B為按1.2.3方法制備的野生品種色譜圖，圖1C為按1.2.3方法制備的栽培品種色譜圖。HPLC色譜分析結果表明，野生品種、栽培品種中所含核苷類成分與核苷對照品組成相同，保留時間一致。

1：尿嘧啶；2：胞苷；3：鳥嘌呤；4：尿苷；5：腺嘌呤；6：鳥苷；7：胸苷；8：腺苷；9：2′-脫氧腺苷1: Uracil; 2: Cytosine; 3: Guanine; 4: Uridine; 5: Adenine; 6: Guanosine; 7: Thymidine; 8: Adenosine; 9: 2 ′-Deoxyadenosine圖1 滇重樓HPLC圖Fig.1 HPLC Spectrums of Paris polyphylla

2.2 樣品核苷類成分含量

按1.2.3方法制備33批滇重樓根莖的供試品溶液，其中16批為野生品種，17批為栽培品種，平行3份，在1.2.1色譜條件下進行測定，計算滇重樓根莖中9種核苷類成分的含量，結果見表3。從表3可知，野生品種各核苷類成分含量為尿嘧啶0.151(Y16)～1.557 mg/g(Y3)，胞苷0.400(Y10)～1.747 mg/g(Y9),鳥嘌呤1.045(Y8)～5.528 mg/g(Y5)，尿苷1.138(Y3)～5.284 mg/g(Y5)，腺嘌呤0.401(Y8)～2.259 mg/g(Y10)，鳥苷0.728(Y16)～4.104 mg/g(Y2)，胸苷1.017(Y2)～4.650 mg/g(Y5)，腺苷1.170(Y11)～4.860 mg/g(Y6)，2′-脫氧腺苷0.415(Y11)～2.213 mg/g(Y6)；栽培品種各核苷類成分含量為尿嘧啶0.252(Z25)～2.461 mg/g(Z18)，胞苷0.153(Z23)～1.492 mg/g(Z21)，鳥嘌呤0.839(Z31)～4.140 mg/g(Z24)，尿苷1.115(Z23)～4.935 mg/g(Z30)，腺嘌呤0.538(Z31)～1.950 mg/g(Z24)，鳥苷1.028(Z23)～4.514 mg/g(Z21)，胸苷0.311(Z23)～2.760 mg/g(Z17)，腺苷0.775(Z23)～6.103 mg/g(Z21)，2′-脫氧腺苷0.161(Z25)～1.278 mg/g(Z21)。

2.3 樣品核苷類成分t檢驗

采用軟件SPSS 22.0對全部樣品進行獨立樣本t檢驗分析見表4。通過分析可知野生品種與栽培品種滇重樓中胞苷、胸苷、2′-脫氧腺苷含量有顯著性差異(Sig.<0.05)，而尿嘧啶、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷含量差異無顯著性(Sig.>0.05)。

2.4 野生樣品與栽培樣品聚類分析

以9種核苷成分為依據(jù)，采用SPSS 22.0軟件對33批滇重樓樣品進行聚類分析(圖2)。結果顯示，33批樣品可被分為2大類：第Ⅰ類：Y10、Y5、Z18、Z24和Y7；第Ⅱ類：Z21、Y14、Z22、Z33、Z30、Y9、Y6、Y11、Z17、Y3、Y1、Y12、Y16、Y15、Y8、Y13、Y4、Z23、Z31、Z20、Z26、Z25、Z32、Z28、Z27、Y2、Z29和Z19。結果顯示，野生品種和栽培品種之間相互交叉，滇重樓野生品種和栽培品種無生境依賴性，生長環(huán)境不是影響核苷類成分含量的因素。

2.5 野生樣品與栽培樣品主成分分析

采用SIMCA-P13.0和SPSS 22.0軟件對33批滇重樓樣品進行主成分分析(圖3)。結果顯示，在所有主成分構成中，信息主要集中在前3個主成分中，其貢獻率分別為42.15 %，25.94 %和12.78 %，累積貢獻率為80.87 %。故選定前3個主成分來概括33批樣品核苷類含量的信息。對主成分1貢獻較大的是鳥苷、鳥嘌呤和尿苷；對主成分2貢獻較大的是尿嘧啶和腺嘌呤；對主成分3貢獻最大的是2′-脫氧腺苷。分別對3個主成分進行得分計算并排序，主成分1得分最高的是Y5，為4.945；主成分2得分最高的是Z18，為3.622；主成分3得分最高的是Y2，為2.034；綜合得分最高的樣品是Y5，為3.113。根據(jù)PCA分析圖可知，野生組樣品和栽培組樣品混合分布，無法進行有效區(qū)分。

表3 樣品中9種核苷類的含量

續(xù)表3 Continued table 3

分組Grouping樣品編號Sample number尿嘧啶Uracil胞苷Cytosine鳥嘌呤Guanine尿苷Uridine腺嘌呤Adenine鳥苷Guanosine胸苷Thymidine腺苷Adenosine2′-脫氧腺苷2 ′-Deoxyadenosine總計(mg/g)TotalZ260.388±0.0080.270±0.0801.014±0.0422.929±0.0610.621±0.0831.094±0.0080.595±0.0181.866±0.0100.324±0.0469.101Z270.810±0.0520.538±0.0041.459±0.0383.175±0.1791.212±0.1022.475±0.0261.573±0.0482.461±0.0270.379±0.04914.082Z280.444±0.0360.438±0.0430.889±0.0382.451±0.0291.137±0.0252.243±0.0330.952±0.0742.439±0.0770.436±0.01111.429Z290.373±0.0210.395±0.0310.908±0.0364.604±0.0650.735±0.1302.692±0.1390.723±0.0442.929±0.0200.404±0.04513.763Z300.641±0.0600.955±0.0523.171±0.0894.935±0.0990.851±0.0342.612±0.0441.063±0.0235.788±0.0300.672±0.08120.688Z310.267±0.0420.952±0.0360.839±0.0652.421±0.1450.538±0.0331.726±0.0530.492±0.0202.708±0.0360.238±0.00710.181Z320.532±0.0550.527±0.0241.356±0.0732.872±0.0580.565±0.0112.078±0.1611.343±0.0593.280±0.0510.637±0.06713.190Z330.461±0.0100.923±0.0792.731±0.1204.182±0.1910.936±0.0792.680±0.0961.070±0.0535.025±0.0840.744±0.11518.752平均值0.7230.6741.9113.2070.9672.3621.2373.0180.54814.647

表4 野生與栽培滇重樓獨立樣品t檢驗

3 討 論

通過測定滇重樓野生品種和栽培品種的核苷類成分可知，33批樣品中均含有尿嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷和2′-脫氧腺苷這9種核苷，說明野生與栽培滇重樓根莖中的核苷類成分較為相似。對33批樣品進行含量測定和獨立樣本t檢驗，結果表明不同產(chǎn)地的滇重樓的核苷含量不同。貴州省和云南省栽培品種的核苷總量較野生品種的核苷總量稍低，但差異無統(tǒng)計學意義，這可能與培育技術、種植模式等有關；四川省栽培品種的核苷總量是野生品種的2.377倍，這可能與四川產(chǎn)地栽培品種和野生品種批次較少、生長環(huán)境有關，有待于進一步收集實驗材料進行研究。成分含量結果表明，野生品種與栽培品種的胞苷、胸苷、2′-脫氧腺苷含量差異具有統(tǒng)計學意義，其他6種核苷的含量差異無統(tǒng)計學意義，在一定程度上說明野生品種和栽培品種在化學成分種類和化學成分含量上均表現(xiàn)出一定的相似性。

圖2 野生品種與栽培品種聚類分析Fig.2 Cluster analysis of wild and cultivated varieties

R2×[1]=0.4 R2×[2]=0.252 Ellipse:Hotelling’s T2(95 %)圖3 野生品種與栽培品種主成分分析Fig.3 PCA of wild and cultivated varieties

通過多元統(tǒng)計學聚類分析和主成分分析均顯示野生滇重樓和栽培滇重樓無法有效地區(qū)分，提示二者無顯著性差異，詹曉如等[9]利用分光光度法測定七葉一枝花野生品種與移栽品種薯蕷皂苷元含量，同樣得出二者無明顯差別的結論。栽培在一定程度上保留了野生環(huán)境下的物種信息，并可有效地縮短入藥年限，栽培后可以更好地按照規(guī)范化種植標準進行田間管理，進而有效地保證重樓藥材的質(zhì)量，從根本上解決藥材質(zhì)量差、資源瀕危和生態(tài)環(huán)境惡化等問題，以實現(xiàn)生態(tài)環(huán)境保護、資源再生和綜合利用及中藥材生產(chǎn)。因此，課題組認為栽培滇重樓可以作為野生滇重樓的替代資源使用，具有質(zhì)量等同性。

4 結 論

野生滇重樓和栽培滇重樓的核苷類成分含量無明顯差異，栽培滇重樓可作為野生滇重樓的替代資源使用。