大豆肽酶解制備工藝研究

吳紅月

(石家莊財經職業學院 河北石家莊 050200)

我國大豆年產量約2 000 萬t，占世界總產量的9%，居第三位[1-3]，但是，我國目前大豆種植處于高產出低收益的狀態，與發達國家大豆的高產出、高收益，甚至低產出、高收益狀態形成了鮮明對比。因此，如何開發利用大豆蛋白質資源已成為我國目前研究的大勢所趨[4-5]。加強對大豆蛋白的研究與開發，使之生產規模化和工業化，對高效利用我國的大豆蛋白資源，具有重大的社會意義，并能有良好的經濟效益[6]。目前，我國科學家對大豆多肽的生產研究很多，但是沒有形成大規模化、工業化生產[7]。其主要原因是生產成本頗高，這樣使得產品因為高成本、低附加值，很難全面推向市場。

功能性蛋白肽又被稱為生物活性肽，是指天然氨基酸以不同組成和排列方式構成、分子質量一般小于6 000 KDa、在構想上比較松散，對生物機體的生命活動有益或具有特定生理作用的多肽或者寡肽類的總稱[8-10]。一般由2～50個與同源蛋白質相同的氨基酸組成，其消化吸收性能比蛋白質更好，且能參與或調節動物某些生理活動。其中氨基酸殘基數大于等于10 的稱為多肽，低于10的稱為寡肽，含2～3個氨基酸殘基的為小肽[11-12]。

目前，常見的大豆肽生產主要是以分離的大豆蛋白為原料，添加蛋白酶制劑將大豆蛋白進行水解，最后得到大豆肽，這是大幅降低生產成本的主要原因[13]。

1 材料與儀器

1.1 原料制備

（1）豆粕進行粉碎，過篩60～100目篩，檢測。

（2）蛋白酶：酸性、中性、堿性蛋白酶一種或幾種。

中性蛋白酶（15萬U/g；河北創之源生物科技有限公司）；中性蛋白酶（20萬U/g；河南萬永生物科技有限公司）；酸性蛋白酶（20萬U/g；江蘇久佳生物科技有限公司）；堿性蛋白酶（50萬U/g；江蘇久佳生物科技有限公司）。

（3）半纖維素酶，甘露聚糖酶的一種或多種。

1.2 酶解制備大豆肽

首先稱取一定量2.1 制備的原料，底物添加量為10%～25%，加水攪拌均勻，調節pH為4～7之間，加入半纖維素酶和甘露聚糖酶1∶1復合物200 U/g，50 ℃酶解4～6 h，然后加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶（1∶1）2 000～4 000 U/g，50 ℃，再酶解8～22 h，酶解液升溫至90 ℃，保溫15 min，即為豆粕酶解液。經離心，膜過濾，濃縮。在進樣溫度為160 ℃，出口溫度為≥85 ℃，此時進料速率成為14%～20%，制備樣品。

1.3 樣品檢測

1.3.1 蛋白質、肽含量和氨基酸測定

依據國標GBT 22492-2008，測定蛋白質、肽含量和氨基酸含量。

1.3.2 三氯乙酸法測定酸性蛋白

（1）處理。

稱取M=1.000 g（精確到0.001 g），加入15%三氯乙酸（TCA）溶液溶解，并定容至50 mL，混勻并靜止5～30 min，過濾，去除初濾液約5 mL（通常濾液的過濾都是干過濾。干過濾就是用干濾紙、干漏斗、將溶液過濾，濾液收集于干燥容器中)收集過濾液備用。吸取過濾液體10～20 mL進行凱氏定氮。

（2）結果計算。

酸性蛋白含量(%)=[(V2-V1)×C×0.014×6.25]/(M×V3/50)

式中：V2為滴定試樣時所需標準酸溶液體積，mL；

V1為滴定空白時所需標準酸溶液體積，mL；

V3為吸取過濾液體積，mL；

C為鹽酸標準溶液濃度，mol/L；

m為試樣質量，g；

0.014 為每毫克當量氮的克數；

6.25 為氮換算成蛋白質的平均系數。

1.3.3 AOAC2017法測定膳食纖維含量

總膳食纖維（TDF）是第一酶解，第二用乙醇沉淀，第三將沉淀物過濾，用乙醇和丙酮對TDF殘渣沖洗，干燥稱重。不溶性（IDF）是酶解后，將IDF 過濾，過濾結束后的殘渣用熱水沖洗，經干燥后稱重。可溶性膳食纖維（SDF）是將上述濾出液用4 倍量的95%乙醇進行沉淀，然后再過濾，干燥，稱重。AOAC 法樣品制備如下。

（1）消化樣品。

①準確稱取兩份（1.000±0.005）g樣品（M1和M2），置于500 mL 三角瓶中。②在每個三角瓶中依次加入95%乙醇1 mL，馬來酸緩沖液35 mL，加入復合酶PAA（4KU）/AMG（1.7KU）5 mL。加入轉子攪拌溶解，攪拌直到樣品完全分散，必要時在磁力攪拌器上攪拌（目的是防止形成團塊，避免受試物與酶不能充分接觸）。③用淀粉酶（熱穩定的）進行酶解處理：37 ℃酶解4 h，低速攪拌。酶解結束，加入3 mL Tris 堿溶液，調節pH 在8.1～8.3，將燒杯蓋住（用鋁箔片），在沸水浴（95 ℃～100 ℃）中進行反應，時間為15 min（要求最開始的水浴溫度應達到95 ℃）。④冷卻：將所有進行反應的三角瓶從水浴中取出，進行冷卻（放置已預熱至60 ℃的水浴鍋中）。⑤用蛋白酶進行酶解處理：在反應燒杯中分別加入100 μL 蛋白酶溶液。用鋁箔將燒杯蓋住，在60 ℃持續搖動的環境中進行反應30 min（初始的水浴溫度應達60 ℃），確保充分反應。⑥pH值測定：30 min后，打開燒杯的蓋，邊攪拌邊加入4 mL2mol/L醋酸溶液至三角瓶中，調節pH至4.3左右，然后加入1 mL glycerol標準品。

（2）膳食纖維測定。

①用乙醇沉淀膳食纖維：在每份樣品中，加入95%乙醇220 mL。室溫下沉淀1 h（或過夜處理）。

表3 AOAC法檢測半乳甘露聚糖結果

②過濾裝置：將已經濕潤的硅藻土（用15 mL 78%乙醇進行濕潤）分布在已稱重的坩堝中。用適度的抽力把坩堝中的硅藻土吸到玻板上。

③酶解過濾，用78%乙醇和刮勺轉移所有內容物微粒至坩堝中，若一些樣品形成膠質，用刮勺破壞表面，以加速過濾。

④抽真空，分別用15 mL的78%乙醇，95%乙醇和丙酮沖洗殘渣，此過程重復2次，將坩堝內的殘渣抽干后在105 ℃烘干12 h。然后將坩堝置干燥器中冷卻至室溫。稱量包括膳食纖維殘渣和硅藻土的坩堝重量，精確稱至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土的干重，并計算殘渣重。過濾液定容至300 mL，進行液相測定。

⑤蛋白質和灰分的測定：取兩份平行樣品中的一份測定蛋白質，用（N×6.25作為蛋白質的轉換系數）。

測定灰分時，用平行樣品的第二份，將其在525 ℃灼燒5 h，然后在干燥器中冷卻，精確稱至0.1 mg，減去坩堝和硅藻土的重量，即為灰分重量。

⑥溶液進行液相測定。

（3）計算。

TDF、IDF、SDF均用同一公式計算。膳食纖維（DF，g/100g）測定：

HMWDF=IDF+SDFP

高分子量膳食纖維=不溶性膳食纖維+大豆膳食纖維（SDFP）/（SJZFP，高分子量可溶性膳食纖維：

式中：R1和R2為雙份樣品殘留物重量（mg）；P和A分別為蛋白質和灰分重量（mg）；M1和M2為樣品重量（mg）。

總膳食纖維=高分子膳食纖維+低分子水溶性膳食纖維。

2 結果分析

在單因素基礎上，通過放大實驗，表1研究結果表明：底物濃度為25%，加入半纖維素酶和甘露聚糖酶1∶1復合物200 U/g，pH值為6，50 ℃酶解6 h，添加復合蛋白酶，酶量為3 000 U/g,反應時間為18 h，在此條件下酶解液中肽得率最高為49.76%。

表1 不同酶組合測得數據表

根據表2 中氨基酸分析表明，制備樣品中賴氨酸含量為30.59 g/kg，脯氨酸含量為45.16 g/kg，天冬氨酸含量為63.49 g/kg，精氨酸含量為72.68 g/kg，谷氨酸含量為143.37 g/kg。

表2 制備樣品18種氨基酸檢測數據（單位：g/kg）

通過以上實驗可以得出，以大豆豆粕為反應底物，用復合蛋白酶將其進行水解，對反應條件（底物濃度、反應溫度、pH 值、反應時間、酶用量）等工藝參數進行了系統的研究分析，并總結大豆肽含量及大豆蛋白水解度與各影響因子之間的關系；研究結果表明：底物濃度為25%，加入半纖維素酶和甘露聚糖酶1∶1 復合物200 U/g，pH值為6，50 ℃酶解6 h，添加復合蛋白酶，酶量為3 000 U/g,反應時間為18 h，在此條件下酶解液中肽得率最高為49.76%。通過氨基酸檢測發現進一步改變蛋白質的品質，有利于畜禽的消化吸收；通過AOAC法檢測可知，制備樣品總膳食纖維為15.56%，粗纖維降低，可發酵基纖維含量降低13.39%，有利于畜禽的消化吸收，有益于腸道益生菌的增值，同時增加適口性和消化率。此研究使豆粕降解工業化，對有效利用我國的植物蛋白資源，具有重大的社會意義和良好的經濟效益。