人臍帶間充質干細胞對早發性卵巢功能不全大鼠的影響

莊亞瓊　楊晴晴　段暢　張林東　封全靈

【摘要】 目的：探討人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）對早發性卵巢功能不全模型大鼠卵巢功能的影響。方法：將正常動情周期的36只雌性ICR小鼠按隨機數字表法分為移植組（n=12）、模型對照組（n=12）與空白對照組（n=12）。空白對照組大鼠不進行任何處理，模型對照組和移植組大鼠腹腔注射順鉑（CDDP）建立早發性卵巢功能不全（POI）模型。移植組通過尾靜脈注射hUCMSCs進行治療，模型對照組與空白對照組均注射等量滅菌用水。移植后2周，觀察三組一般情況，HE染色三組的切片中各階段的卵泡情況，同時觀察卵巢結構變化。測定血清中雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）和抗苗勒管激素（AMH）水平，并分析卵巢儲備功能的變化。結果：電鏡下顯示，模型對照組顆粒細胞核溶解、核膜消失、線粒體空泡化，線粒體與內質網數量逐漸減少。移植組顆粒細胞細胞核膜逐漸修復，核仁出現，內質網與線粒體少量存在。造模后3 d，模型對照組E2含量低于空白對照組，FSH含量高于空白對照組（P<0.05）。移植后2周，移植組AMH含量高于模型對照組（P<0.05），三組AMH比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：hUCMSCs移植對POI大鼠的卵巢結構和功能具有一定的修復作用。

【關鍵詞】 間充質干細胞; 早發性卵巢功能不全; 順鉑

Effects of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells on Rats with Premature Ovarian Insufficiency/ZHUANG Yaqiong，YANG Qingqing，DUAN Chang，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（23）：0-018

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells（hUCMSCs）on ovarian function in rats with early-onset ovarian dysfunction.Method：36 female ICR mice with normal estrous cycle were divided into transplantation group（n=12），model control group（n=12）and blank control group（n=12）according to random number table method.The blank control group without any treatment.The model control group and transplantation group rats were intraperitoneally injected with cisplatin（CDDP）to establish premature ovarian insufficiency（POI）model.The transplantation group was treated with intravenous injection of hUCMSCs.The model control group and blank control group were injected with the same amount of sterilizing water.2 weeks after transplantation，the general conditions of the three groups were observed，and the follicular conditions at each stage in the sections of the three groups with HE staining were observed，and the structural changes of the ovary were observed at the same time.The levels of estradiol（E2），follicle stimulating hormone（FSH），luteinizing hormone（LH）and anti-Mullerian hormone（AMH）in serum were measured，and the changes of ovarian reserve function were analyzed.Result：Electron microscopy showed that the number of mitochondria and endoplasmic reticulum decreased gradually in the model control group，while the number of nuclear membrane repaired gradually，nucleolus appeared，and endoplasmic reticulum and mitochondria existed little in the transplantation group.3 days after modeling，E2 content in the model control group was lower than that in the blank control group，and FSH content was higher than that in the blank control group（P<0.05）.At 2 weeks after transplantation，AMH content in the transplantation group was higher than that in the model control group（P<0.05）.AMH in the three groups were compared，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：hUCMSCs transplantation can repair the ovarian structure and function of POI rats.

【Key words】 Mesenchymal stem cells; Premature ovarian insufficiency; CDDP

First-authors address：Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.23.004

早發性卵巢功能不全（POI）指女性在40歲之前卵巢活動衰退的臨床綜合征，以月經紊亂（如停經或稀發月經）伴有高促性腺激素和低雌激素為特征。停經或月經稀發4個月，間隔>4周連續兩次，FSH>25 U/L[1]。POI主要引起雌激素缺乏癥狀，進一步發展會導致卵巢早衰（POF）生育能力下降，目前POI治療方式有HRT激素治療和免疫治療等方法恢復卵巢功能，但是這些治療效果不能促進自身卵巢組織再生修復[2]。近年來，國內外試圖應用臍帶間充質干細胞治療卵巢早衰，利用動物模型進行了探索，為早發性卵巢功能不全（卵巢早衰）患者的治療提供了可能的新希望。在化療藥物的應用過程中發現有些患者在使用化療藥物后出現了如持續閉經和潮熱、多汗等低雌激素表現，內分泌檢查結果提示卵巢功能減退并引起患者的不孕。本研究應用人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）治療由順鉑（CDDP）引起的卵巢早衰大鼠，觀察卵巢結構及激素水平變化，為指導臨床提供依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）hUCMSCs的分離、培養與鑒定。選取2018年12月于鄭州大學第三附屬醫院足月分娩產婦胎兒的臍帶樣本。產婦產前1個月內均行母血檢測，無各種傳染疾病的健康孕婦。收集前所有患者及家屬均知情同意，并簽署知情同意書，本研究經過鄭州大學第三附屬醫院倫理委員會批準，在嚴格無菌的條件下提取正常分娩的足月健康新生兒的臍帶和胎盤，將臍帶剔除動靜脈血管，分離出的臍帶切割成1～2 mm的小塊，采用貼壁法進行原代細胞培養，貼壁細胞保存備用。在合適的培養基和環境下對hUCMSCs五代細胞株進行復蘇、培養擴增、傳代和保存。采用流式細胞儀鑒定，選擇生長良好的第5代的hUCMSCs，用1 mL注射器將1 mL細胞懸液注入移植組小鼠的尾靜脈中。（2）實驗動物和試劑：陰道涂片提示有正常的發情周期的ICR雌性大鼠36只，體重（200±12）g，購自動物中心。將36只雌性大鼠按隨機數字表法分為空白對照組

12只，模型對照組12只，移植組12只。CDDP購自武漢博士德公司;檢測血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）和抗苗勒管激素（AMH）濃度的ELISA 試劑盒購自北京金橋生物。

1.2 方法 POI模型大鼠建立模型：對照組和移植組腹腔注射CDDP溶液，第1天注射 50 mg/kg，第2天連續注射16 mg/kg。空白對照組注射等體積滅菌用水。模型對照組造模后無額外處理，觀察記錄大鼠一般情況，造模前及造模后3 d尾靜脈采血，檢測FSH、E2含量。移植組在造模完成后尾靜脈注射1×106/mL的hUCMSCs單細胞懸液1 mL。模型對照組與空白對照組均注射等量滅菌用水。

1.3 觀察指標 造模后3 d，利用生化方法測定并比較空白對照組與模型對照組雌激素（E2）與抗苗勒管激素（AMH）的水平。移植后2周，利用生化方法測定并比較三組卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）及AMH水平，HE染色電鏡下觀察CDDP標本及空白對照組的切片中各階段的卵泡情況，同時觀察卵巢結構變化。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組卵巢結構 hUCMSCs移植后2周，空白對照組顆粒細胞的細胞面膜完整、細胞無水腫，線粒體分布均勻、清晰可見，細胞核內染色質均勻，內質網清晰可見，無擴張現象，屬正常顆粒細胞形態。模型對照組顆粒細胞的細胞核溶解，核膜消失，染色質固縮、邊聚，有凋亡小體出現，線粒體空泡化，線粒體、內質網、溶酶體等細胞器數減少，移植組顆粒細胞核膜逐漸修復，核仁出現，內質網與線粒體少量存在。見圖1。

2.2 三組卵巢大體觀 空白對照組大鼠卵巢外觀無異常，造模后大鼠卵巢比空白對照組明顯縮小，卵巢表面的顆粒樣隆起明顯減少，卵巢可見局部有充血現象。模型對照組和移植組卵巢外觀相比差異不明顯。

2.3 三組各階段卵泡計數比較 三組始基卵泡、初級卵泡、竇卵泡和次級卵泡個數比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.4 造模后3 d空白對照組與模型對照組E2、FSH水平 模型對照組E2含量低于空白對照組，模型對照組FSH含量高于空白對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.5 三組卵巢儲備功能變化 移植后2周，三組FSH/LH水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05），移植組AMH含量高于模型對照組，差異有統計學意義（P<0.05），三組AMH比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

近些年來，間充質干細胞廣泛應用于臨床各種疾病的治療研究，其類型主要有臍帶間充質干細胞和骨髓間充質干細胞，骨髓間充質干細胞應用于臨床的年份較長，應用過程中出現了各種不足，骨髓間充質干細胞需要對患者進行骨髓穿刺，引起患者的疼痛不適，甚至得不到患者的配合，且骨髓間充質干細胞隨著供體年齡的增長分化能力和細胞數量均不能達到理想的效果，無論自體移植還是異體移植均有可能造成感染[3-4]。這些問題使骨髓間充質干細胞的應用大大受到了限制。而臍帶間充質干細胞的生長環境更易實現，臍帶間充質干細胞具有更強的增殖分化能力與低免疫原性，而且細胞來源相對安全提取和培養更加方便，不會給患者帶來額外的痛苦，也不易造成疾病在人群間的傳播[5-7]。基于臍帶間充質干細胞的這些優點，其未來在臨床可能擁有更好的發展前景，可能成為治療疾病的一種干細胞類型，在臨床上推廣更具有優勢[8]。

間充質干細胞治療在動物實驗和臨床研究領域獲得了很大的進展，部分研究成果已開始在惡性腫瘤、自身免疫系統疾病、神經系統疾病、心血管疾病等多種臨床試驗中得到應用。其中hUCMSCs在狼瘡性腎炎、類風濕關節炎、糖尿病、神經障礙性疾、失代償期肝硬化、肝衰竭等疾病的臨床治療研究中取得的成果，提示干細胞移植治療有可能是未來卵巢早衰治療的一個方向[9-11]。

順鉑是一種常用的化療藥物，有研究表明其在殺死腫瘤細胞的同時也可對正常細胞造成不同程度的傷害，順鉑化療過程中引發卵巢功能低下的報道逐年增加[12-14]。本研究通過順鉑作用于大鼠建立早發卵巢功能不全模型，結果得出：造模后3 d，模型對照組E2含量低于空白對照組（P<0.05），FSH含量高于空白對照組（P<0.05），提示造模成功。之后對CDDP建立的早發卵巢功能不全的大鼠模型進行尾靜脈注射治療，移植后2周，移植組AMH含量高于模型對照組（P<0.05），提示移植組的大鼠卵巢功能得到了有效的改善，人臍帶間充質干細胞能夠在CDDP建立的早發卵巢功能不全的大鼠體內存活和轉移，并且能夠對大鼠血清中的FSH、E2、AMH、LH這些激素水平產生影響，鏡下觀卵巢結構中顆粒細胞核膜逐漸修復，核仁出現，內質網與線粒體少量存在，可見臍帶間充質干細胞可以促進卵巢顆粒細胞的再生。

本研究為期待間充質干細胞治療早發性卵巢功能不全的治療提供了理論依據，初步探討靜脈注射方法的可行性，為臍帶間充質干細胞在臨床和基礎研究領域提供了一些新的思路，為臨床上治療早發性卵巢功能不全提供新的方法。為化療藥物導致的POI的治療提供新的臨床借鑒研究。近年來POI的發病率呈上升趨勢。POI不但導致年輕女性閉經、繼發性不孕、低雌激素等臨床癥狀，且對患者神經系統、心腦血管、內分泌、骨骼等全身多器官構成影響，嚴重影響患者的身心健康[15-20]。但是POI還沒有非常有效的治療方法，因此針對POI的相關研究將為該疾病的治療具有重要的應用價值。

綜上所述，人臍帶間充質干細胞可以在大鼠體內存活并改善順鉑造模所致卵巢早發功能不全，可以在一定程度上修復卵巢的內分泌功能。但是人臍帶間充質干細胞能否在人體內存活和發揮作用以及其發揮作用的具體機制仍需免疫學及移植試驗進一步研究驗證。

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（收稿日期：2019-04-15） （本文編輯：田婧）