電感耦合等離子體質譜法結合模式識別的生/制何首烏無機元素差異研究

林艷　夏伯候　李春　廖端芳　林麗美　劉月新

摘要：目的 ?建立生/制何首烏無機元素的電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析方法，并采用模式識別對兩者進行鑒別。方法 ?采用ICP-MS測定22批不同產地生/制何首烏無機元素，并用Simca13.0軟件對數據進行主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析。結果 ?22批不同產地生/制何首烏共檢出鎂（Mg）、鉀（K）、鐵（Fe）、釩（V）、鈷（Co）、錳（Mn）、鎳（Ni）、鍶（Sr）、銣（Rb）、鋇（Ba）、砷（As）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、銅（Cu）14種無機元素，其中常量元素以K、Fe、Mg含量較為豐富，微量元素以Mn、Ni、Sr、Rb、Ba含量較為豐富。主成分分析不能將生/制何首烏完全分開，正交偏最小二乘-判別分析能將生/制何首烏基本分開;Cu、Cr、Ni、Mg為生/制何首烏最主要的差異性無機元素，其中Cu（VIP=2.2）對生/制何首烏的差異貢獻最大。結論 ?本研究成功采用ICP-MS從無機元素角度區分了生/制何首烏，可為中藥材質量控制提供參考。

關鍵詞：電感耦合等離子體質譜;生何首烏;制何首烏;無機元素;模式識別;銅

中圖分類號：R284.1 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）09-0069-04

Study on Differences of Inorganic Elements Between Crude and Processed Polygonui Multiflori Radix Using ICP-MS and Pattern Recognition

LIN Yan^1，2， XIA Bohou^1，2， LI Chun^2，3， LIAO Duanfang^1，2， LIN Limei^1，2， LIU Yuexin^1，2

1. College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan Province， Changsha 410208， China; 3. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China

????Abstract： Objective To study the differences of inorganic elements between crude and processed Polygonui Multiflori Radix?by ICP-MS; To use pattern recognition to identify the two.?Methods The inorganic elements in 22 batches of crude and processed Polygonui Multiflori Radix were determinated by ICP-MS， which were analyzed by PCA and OPLS-DA of Simca13.0 software. Results?There were 14?common inorganic elements in the 22 batches?of crude and processed Polygonui Multiflori Radix， which were Mg， K， Fe， V， Co， Mn， Ni， Sr， Rb，?Ba， As， Pb， Cr and Cu. The contents of K， Fe， and Mg were abundant in the macro element， and Mn， Ni， Sr， Rb，?Ba were abundant in the micro element. These samples could not be completely divided into two categories by PCA， but they could be divided into two categories by OPLS-DA. Cu， Cr， Ni， and Mg were identified as the main different inorganic element， in which Cu （VIP=2.2） was the most different inorganic element. Conclusion The study can successfully identify the crude and processed Polygonui Multiflori Radix by?ICP-MS， and can provide reference?for quality control of TCM.

????Keywords：?ICP-MS; crude Polygonui Multiflori Radix; processed Polygonui Multiflori Radix; inorganic elements; pattern recognition; Cu

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum?Thunb.的干燥塊根。生何首烏苦泄性平兼發散，具有解毒消癰、潤腸通便、截瘧功效;制何首烏味甘厚性溫，具有補肝腎、益精血、烏須發和強筋骨功效^[1]。藥理研究表明，何首烏具有抗衰老、提高免疫力、抗動脈粥樣硬化等作用，毒理作用主要表現為肝毒性^[2-3]。何首烏主要含有二苯乙烯苷、蒽醌、鞣質等活性成分，另外，何首烏中無機元素對藥效和毒性的影響也不能忽視。無機元素測定方法主要有原子熒光法、原子吸收分光光度法和電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）等^[4]。ICP-MS具有靈敏度高、分析速度快等優點，已在中藥無機元素的分析測定中推廣^[5-6]。現有的何首烏無機元素研究局限于無機元素含量的測定，而對生/制何首烏所含無機元素的差異性研究鮮有報道。因此，本研究建立不同產地生/制何首烏無機元素的ICP-MS檢測方法，結合模式識別對測定結果進行分析，為何首烏鑒別和質量控制提供依據。

1 ?儀器與試藥

Agilent 8800三重四極桿ICP-MS儀（Agilent Technologies），101-3A型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），CP114電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司），0.22 μm微孔濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司），RT-04A型高速粉碎機（香港泓荃制藥機械公司），P60-CW國之源超純水機（科爾頓水務有限公司）。

70%過氧化氫（優級純，批號20161103），硝酸（優級純，批號20171016），國藥集團化學試劑有限公司;含有鎂（Mg）、鉀（K）、鐵（Fe）、釩（V）、鈷（Co）、錳（Mn）、鎳（Ni）、鍶（Sr）、銣（Rb）、鋇（Ba）、砷（As）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、銅（Cu）的多元素標準溶液（10 μg/mL）為國家標準品，安捷倫科技有限公司;市售22批何首烏飲片均經湖南中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室龔力民副教授鑒定為蓼科何首烏Polygonum multiflorum?Thunb.的干燥塊根，樣品來源信息見表1。

2 ?方法與結果

2.1 ?測定條件

工作參數：功率1000 W，冷卻氣流量15.6 L/min，輔助氣流量0.85 L/min，載氣流量0.92 L/min，樣品提升量1.0 L/min，采樣深度10 mm，采樣錐孔徑1.1 mm，截取錐孔徑0.89 mm。

測量參數：停留時間30 ms，重復次數3，測量點/峰3，測量循環次數10，樣品分析時間70 s/個，測量方式為標準曲線法，讀數方式為峰強。

2.2 ?供試品溶液制備

取樣品粉末（過4號篩）約0.5 g，精密稱定，置于聚四氟乙烯消解灌中，加入HNO₃-H₂O₂（4∶1）溶液15 mL，蓋上坩堝蓋，置于通風櫥中靜置過夜，次日于可控溫電熱板上60～80 ℃進行濕法消解，加熱至溶液透明澄清，冷卻至室溫，于通風櫥揮盡酸，用超純水定容至50 mL，搖勻，即得。

2.3 ?對照品溶液制備

取一定量10 μg/mL多元素標準溶液，用1%HNO₃溶液逐級稀釋，得到多元素濃度分別為0.001、0.004、0.016、0.064、0.256、1.024、4.096 μg/mL的對照品溶液，用于含量測定。

2.4 ?標準曲線制備

取14種無機元素的系列濃度對照品溶液，按測定條件依次測定，以對照品濃度為橫坐標，對照品峰強度為縱坐標，繪制標準曲線，得各元素的回歸方程、相關系數和線性范圍，結果見表2。

2.5 ?加樣回收率試驗

取同一批何首烏飲片粉末（S9）樣品6份，每份0.25 g，精密稱定，按樣品中各元素測定量的100%加入相應對照品，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液，進行含量測定，計算加樣回收率，各無機元素的平均回收率為98.12%～102.45%，RSD均小于1.4%。

2.6 ?樣品含量測定

取各樣品供試品溶液，按上述條件測定，結果見表3。22批樣品中常量元素K、Fe、Mg含量較為豐富，微量元素以Mn、Ni、Sr、Rb、Ba含量較為豐富。

2.7 ?化學模式識別

2.7.1 ?主成分分析

采用主成分分析（PCA）對22批何首烏樣品建模，將數據導入Simca13.0軟件，以共有無機元素含量為自變量，以不同批次何首烏為因變量，進行聚類分析。從PCA得分圖（圖1A）可見，此方法不能將22批生/制何首烏完全分開。

2.7.2 ?正交偏最小二乘-判別分析

為了更好建立生/制何首烏無機元素的差異模型，運用正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）繼續分析，結果能將生/制何首烏分成2類（見圖1B）。根據變量在項目中的重要性（VIP值）篩選差異代謝物，并利用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗，以VIP>1及P<0.05確定差異代謝物，發現Cu、Cr、Ni、Mg為生/制何首烏最主要的差異性成分，其中Cu（VIP=2.2）對生/制何首烏的差異性貢獻最大（見圖1C）。

3 ?討論

本試驗對樣品提取溶劑硝酸、高氯酸、硝酸-過氧化氫（4∶1、2∶1、1∶1）進行了詳細考察，確定了樣品處理方法和ICP-MS條件，在此條件下提取的無機元素最多。

本試驗采用ICP-MS分析了不同產地22批何首烏樣品中13種無機元素。結果顯示，K、Fe、Mg等常量元素的含量較豐富，微量元素以Mn、Ni、Sr、Rb、Ba含量較為豐富。K能加強肌肉的韌性和心臟的運動力，促進蛋白質、碳水化合物和熱能代謝，是人體重要的電解質;Fe參與血紅蛋白、肌紅蛋白及多種含鐵酶的合成，對免疫系統有一定影響;Mg在蛋白質和核酸合成，細胞氧化磷酸化、細胞膜的離子轉運等新陳代謝中有重要作用，還與神經和免疫信息傳導有關;Mn是人體必需微量元素，參與多種酶的合成與激活，參與機體糖、脂肪的代謝，加快蛋白質、維生素合成，參與造血過程，調節內分泌，提高超氧化物歧化酶活性，提高機體免疫功能。上述元素所表現出的生理功能與何首烏具有免疫調節、抗氧化、抗衰老、抗動脈粥樣硬化等作用相一致，說明何首烏的無機元素是重要的功效物質。

重金屬及有害元素是中藥安全性評價的重要指標，《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》限量標準規定Cu≤20.0 μg/g、Pb≤5.0 μg/g、As≤2.0 μg/g^[7]。本研究測定的22批何首烏樣品Cu均符合標準，S11、S20的Pb超標，S11、S16、S19、S20的As超標。為確保臨床用藥安全，重金屬及有害金屬限量控制應引起足夠重視。

計算機模式識別技術是一種有效研究高維空間的手段，能將高維空間的樣本進行點分布，利用數學模型降維，對樣本點進行比較、判別及預報等研究，進而討論變量間的關系。中藥無機元素與藥效存在一定關系，選用合適的元素為特征參量對各類中藥進行識別，其平均準確率>85%，可用于中藥分類和道地藥材鑒別^[8]。應用模式識別研究中藥功效和微量元素的關系，表明無機元素含量是中藥功效的物質基礎之一，每一類藥物中微量元素總體水平相近^[9]。本研究通過模式識別分析，建立了生/制何首烏的分類模型，并確定Cu是生/制何首烏中最主要的差異性元素。制何首烏Cu含量明顯高于生何首烏，同時，制何首烏的抗衰老、增強免疫和抗動脈粥樣硬化等功能明顯強于生何首烏^[10-12]，表明無機元素含量與中藥功效有關。Cu參與微生素合成，為超氧化物歧化酶活性中心，對機體新陳代謝起促進和協調作用，能增強人體免疫功能，提高白細胞殺菌能力^[13]。Cu參與賴氨酸氧化酶的合成，參與彈性蛋白和膠原蛋白的合成，彈性蛋白和膠原蛋白的質和量影響血管系統尤其是大動脈管壁的完整性;缺Cu時，賴氨酸氧化酶作用減弱，彈性蛋白和膠原纖維發生降解，血管壁內膜受損，血管脆性增加、彈性降低，從而引發動脈粥樣硬化^[14]。缺Cu會導致貧血，能量代謝異常，可表現出神經系統癥狀（如銅缺乏綜合征等）;導致毛發色素脫失，機體易出血和凝血時間延長^[15]。ICP-MS結合模式識別可有效地區分生/制何首烏，可為何首烏的質量控制提供新的參考方法，并為中藥質量控制提供范例。

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