葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

班宜輝，徐舟影，李 靜，李 媛，陳碧峰，李俊麗，謝 浩

葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

班宜輝1，徐舟影2，李 靜1，李 媛1，陳碧峰1，李俊麗1，謝 浩1

（1. 武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2. 武漢理工大學(xué) 土木工程與建筑學(xué)院，湖北 武漢 430070）

植物光合作用是植物生理學(xué)及相關(guān)課程的重要研究內(nèi)容，而葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)是快速、準(zhǔn)確探測植物生理狀況的重要技術(shù)手段。該文設(shè)計(jì)了綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目“利用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)研究不同溫度和水分條件對植物光合作用的影響”，研究不同溫度和水分脅迫對植物光合特性的影響。該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)施，能夠使學(xué)生熟悉調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x的工作原理，掌握葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)，從而提高學(xué)生獨(dú)立開展科研項(xiàng)目的能力以及創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力。

葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)；光合作用；溫度脅迫；水分脅迫

光合作用是全球碳循環(huán)的驅(qū)動(dòng)因子，是地球上絕大部分生命得以維系的物質(zhì)來源，是植物重要的生理過程。光合作用相關(guān)參數(shù)測定和分析，一直是植物生理學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)課程的重點(diǎn)內(nèi)容[1]。葉綠素?zé)晒馀c植物光合作用關(guān)系密切，是植物葉綠素吸收能量后釋放的一種長波信號，包含了十分豐富的光合作用信息,使用特定的熒光參數(shù)可估算線性電子傳遞速率、同化速率以及光合系統(tǒng)熱耗散的變化[2-4]。因此，作為體外快速無損害檢驗(yàn)光合作用的探針，葉綠素?zé)晒獬３１挥糜诒O(jiān)測植物光合器官運(yùn)轉(zhuǎn)情況，可以通過對體內(nèi)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定來反映多種逆境因子對植物光合作用的影響[5-6]。溫度和水分脅迫是最常見的植物脅迫因子，不適的溫度條件勢必會(huì)影響植物的光合效率，更易發(fā)生光抑制現(xiàn)象[7-8]，水分脅迫則可抑制光合作用光反應(yīng)中的光能轉(zhuǎn)換、電子傳遞、光合磷酸化和光合作用暗反應(yīng)等一系列過程, 導(dǎo)致光合速率下降，破壞光合作用進(jìn)程[9]。

雖然葉綠素?zé)晒獗粡V泛應(yīng)用于光合作用監(jiān)測，葉綠素?zé)晒鈪?shù)也很容易測得，但葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)大多用于科研領(lǐng)域，學(xué)生在實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)很少有機(jī)會(huì)接觸和掌握這一技術(shù)。為使學(xué)生了解并掌握這項(xiàng)在植物生理學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的先進(jìn)技術(shù)，設(shè)計(jì)了“利用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)研究不同溫度和水分條件對植物光合作用的影響”綜合實(shí)驗(yàn)，采用以學(xué)生自我訓(xùn)練為主的教學(xué)模式，培養(yǎng)學(xué)生數(shù)據(jù)分析和處理能力，提高學(xué)生創(chuàng)新思維，為探究影響光合作用強(qiáng)度的因素提供更多的實(shí)證數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 植物材料

植物材料為玉米（L.），品種為鄭單958。選取大小一致的種子，用1%次氯酸鈉表面消毒5 min，無菌水沖洗3遍，放入無菌培養(yǎng)皿中于25 ℃培養(yǎng)箱中催芽，挑取發(fā)芽一致的種子備用。

1.2 主要儀器

便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x（德國Walz，MiniPAM）、高壓蒸汽滅菌器（日本TOMY，SX-500）、人工氣候箱（上海精宏，RQH-250）。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)采用室內(nèi)盆栽培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌1 h。冷卻后裝盆，塑料盆直徑20 cm，高15 cm，每盆裝0.8 kg。移栽大小一致的玉米幼苗，放置在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃（晝）/18 ℃（夜）、光照強(qiáng)度500 μmol/（m2?s）、每天光照時(shí)數(shù)10 h。每周澆 Hoagland's 營養(yǎng)液[10]，每盆100 mL，配方為10 μmol/L H3BO3、6 mmol/L KNO3、8 mmol/L Ca(NO3)2、1 mmol/L NH4H2PO4、2.6 mmol/L MgSO4、0.5 μmol/L CuSO4、1.0 μmol/L ZnSO4、1.6 μmol/L MnSO4和(NH4)Mo2PO4及2 μmol/L Fe-EDTA，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為6.5。培養(yǎng)15天后，開始進(jìn)行水分脅迫和溫度脅迫。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置6 ℃為低溫脅迫（low temperature stress，LTS）、36 ℃為高溫脅迫（high temperature stress，HTS）及對照（CK，25 ℃）等3種溫度處理。設(shè)置3種水分條件，設(shè)定基質(zhì)含水量占田間持水量的80%為對照（CK），60%為輕度脅迫（light water stress，LWS），30%為重度脅迫（severewater stress，SWS），采用稱重法控制基質(zhì)水分。所有處理均重復(fù)5次。脅迫進(jìn)行1周后測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為教師在示范教學(xué)時(shí)采用的脅迫梯度及標(biāo)準(zhǔn)，學(xué)生在分組實(shí)驗(yàn)時(shí)可自行設(shè)定溫度和水分的脅迫濃度，并可自主選擇脅迫時(shí)間，以充分調(diào)動(dòng)學(xué)生積極性、鍛煉自主科研能力，各小組還能在數(shù)據(jù)處理時(shí)進(jìn)行對比分析，從而得出準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

使用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x（Mini PAM）于上午9：00–10：00測量玉米幼苗完全展開的第2片葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。測定前先將玉米幼苗放在黑暗環(huán)境中暗適應(yīng)20 min左右，測試時(shí)記錄初始熒光（0）、暗適應(yīng)的最大熒光（m）、穩(wěn)態(tài)熒光（t）、作用光關(guān)閉時(shí)的原初熒光（0?）、作用光打開時(shí)的最大熒光（?m）。測量時(shí)，首先用測量光（<0.1 μmol/(m2?s)）激發(fā)葉綠素的本底熒光測定0，再打開一次飽和脈沖光（光子通量密度PFD為8000 μmol/(m2?s)，頻率為20 kHz，1個(gè)脈沖時(shí)間為0.8 s），測定m以及v/m，然后打開作用光（PFD約為336 μmol/(m2?s)，白光）測定光下穩(wěn)態(tài)熒光Ft，再打一次飽和脈沖光測定F?m，關(guān)閉作用光，繼以一次遠(yuǎn)紅外光（PFD約為5 mol/(m2?s)，3 s）測定0?[11]。最小熒光、最大熒光、實(shí)時(shí)熒光測定各處重復(fù)5次。根據(jù)以下公式計(jì)算相關(guān)參數(shù)：

（1）PSII最大量子產(chǎn)量v/m=(m?0)/m；

（2）PSII實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量(II)=(?m?t)/?m；

（3）光化學(xué)熒光淬滅系數(shù)qP=(?m?t)/(?m?0)；

（4）非光化學(xué)熒光淬滅NPQ=(m?m)/?m；

2.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2016和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用SigmaPlot 12.0進(jìn)行圖形制作。數(shù)據(jù)為5次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），組間比較采用方差分析檢驗(yàn)，以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同溫度對玉米葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

3種溫度下玉米葉綠素?zé)晒鈪?shù)v/m、(II)、qP、NPQ的變化見圖1。v/m、(II)、qP等3個(gè)參數(shù)在25 ℃條件（CK）下數(shù)值最高，其次是高溫脅迫（HTS），低溫脅迫（LTS）下數(shù)值最低，且不同條件下的差異均達(dá)到了顯著性（<0.05）。三種溫度條件下的NPQ的數(shù)據(jù)顯示，低溫條件下玉米NPQ值達(dá)到2.33，分別是對照和高溫脅迫下的1.87和1.29倍，差異顯著（<0.05）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，高溫或低溫脅迫均會(huì)對玉米光合系統(tǒng)造成顯著性影響，電子傳遞速率降低，光能利用率下降。與高溫脅迫相比，低溫條件對玉米光合作用效率的抑制作用更加顯著。

3.2 不同水分條件對玉米葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

不同程度水分脅迫下玉米葉綠素?zé)晒鈪?shù)v/m、(II)、qP、NPQ的變化如圖2所示。3種水分條件下v/m、(II)、qP等3個(gè)參數(shù)的數(shù)值變化表現(xiàn)為，正常水分（CK）>輕度脅迫（LWS）>重度脅迫（SWS），且差異均達(dá)到了顯著水平（<0.05）。重度水分脅迫對(II)和qP的影響更為明顯，與對照相比，在重度脅迫下(II)和qP的數(shù)值分別下降了51.8%和51.0%。3種水分條件下的玉米NPQ的數(shù)據(jù)顯示，輕度水分脅迫增加了熱能的損耗，與對照相比提高了17.8%，但二者差異不顯著（>0.05），重度水分脅迫下NPQ值是對照的1.5倍，差異顯著（<0.05）。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，輕度或重度水分脅迫均會(huì)抑制玉米光合作用活性，且重度脅迫顯著增加了熱耗散，降低了植物的光化學(xué)效率，對光合作用的抑制更為顯著。

圖1 溫度脅迫對玉米葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖2 水分脅迫對玉米葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

4 實(shí)驗(yàn)教學(xué)探討

4.1 教學(xué)效果評價(jià)

在植物生理學(xué)相關(guān)課程中，對植物光合作用的常規(guī)測定主要包括測定植物葉面積、葉綠素含量、Mg2+含量等，這些很難準(zhǔn)確、快速地反映植物光合特性，更無法依此評價(jià)環(huán)境因素對植物光合作用的影響。葉綠素?zé)晒夥治鼍哂袦y量快速、準(zhǔn)確可靠、原位測量等優(yōu)點(diǎn)，可以在不破壞葉片的前提下了解葉片內(nèi)部光合作用過程的變化，判斷植物光合特性、受脅迫狀態(tài)、光保護(hù)能力等[12]。

（1）便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x可以實(shí)時(shí)監(jiān)測葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，從實(shí)驗(yàn)開始直至實(shí)驗(yàn)完成都在采集熒光數(shù)據(jù)，且一直處于動(dòng)態(tài)變化過程中。學(xué)生可以根據(jù)圖譜變化實(shí)時(shí)了解植物光合作用狀態(tài)，教師可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變化，隨時(shí)提出問題，引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行分析和討論。學(xué)生在此過程中既能了解儀器的工作原理和操作方法，也能通過分析參數(shù)的變化，理解不同參數(shù)與植物光合活性的關(guān)系。

（2）葉綠素?zé)晒鈨x在植物光合作用測定中的應(yīng)用，增加了實(shí)驗(yàn)過程的“可視性”。借助于熒光儀將“不可視”的熒光信號的變化轉(zhuǎn)換為“可視”的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并以動(dòng)態(tài)曲線的方式呈現(xiàn)在計(jì)算機(jī)上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加清晰明了，給學(xué)生以直觀的印象，更能加深學(xué)生對植物光合作用過程的理解，并明確葉綠素?zé)晒庠谥参锕夂献饔弥械淖饔眉耙饬x。

（3）葉綠素?zé)晒鈨x對熒光信號的采集非常靈敏，在動(dòng)態(tài)檢測光合作用過程中對微小量的變化都可以檢測出來，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)變量的定量檢測，增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。與以往光合作用測定方法相比，數(shù)據(jù)可信度更高。

（4）以往對植物光合作用的測定過程比較繁瑣，需要配制相應(yīng)的試劑，測定過程耗時(shí)較長。葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定過程可以在短時(shí)間內(nèi)完成，實(shí)時(shí)收集 數(shù)據(jù)，大大縮短了實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)，而實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量卻明顯提高。

4.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的選擇

由于葉綠素?zé)晒夥磻?yīng)的過程是光合電子傳遞鏈中能量平衡的過程，對操作環(huán)境及植物生長狀態(tài)十分敏感，因此在應(yīng)用這些葉綠素?zé)晒鈪?shù)來診斷脅迫因素對植物光合作用的影響時(shí)，容易受到許多潛在干擾因素的影響，必須謹(jǐn)慎使用不同的葉綠素?zé)晒鈪?shù)組合[13]。

在諸多葉綠素?zé)晒鈪?shù)中，F(xiàn)v/Fm、Y(II)、qP和NPQ是最為常用的參數(shù)組合，能夠綜合反映脅迫下植物光合特性的變化。Fv/Fm的大小表示PSII受傷害的程度；Y(II)反映了光合鏈上電子傳遞的速率；qP表示葉綠素吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)的大小，也可表示PSII將光能轉(zhuǎn)變?yōu)殡妱菽艿哪芰Γ籒PQ是非光化學(xué)熒光淬滅系數(shù)，它的大小表示葉綠體吸收來的光能以熱能形式散去的部分，在強(qiáng)光下它對保護(hù)PSII的結(jié)構(gòu)有重要作用[14]。

4.3 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

（1）植物種類的選擇及植物幼苗的均一性。調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x的葉夾是固定植物葉片的裝置，上下兩部分打開后可以夾住葉片，夾子上面部分提供了一個(gè)直徑為1 cm的圓形測量孔。因此，為了達(dá)到較好的實(shí)驗(yàn)效果，實(shí)驗(yàn)教學(xué)用的植物材料應(yīng)選擇葉片較大、生長較快的植物，以保證熒光信號的采集不受影響。另外，為了保證植物材料的均一性，應(yīng)選擇育苗時(shí)間相同、大小一致的植物幼苗進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以減小植物個(gè)體差異對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響。

（2）葉片的選擇。許多研究表明，植物不同葉位葉片及同一葉片不同部位的光合速率存在很大的差異，而且不同葉片的著生角度（平展和直立）或取向也對葉片的光合速率有影響。因此，實(shí)驗(yàn)中在作對比測定時(shí)一定要充分注意所測植物葉片的葉位、葉取向和葉部位等葉片諸多因素的一致性和可比性[15]。由于完全展開的葉片的光合活力最高，因此本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目以玉米幼苗完全展開的第2片葉作為樣品葉。如果忽略葉片在光合速率上的差異性，會(huì)引起較大的實(shí)驗(yàn)誤差。

（3）植物培養(yǎng)過程中要考慮“邊緣效應(yīng)”的影響。本實(shí)驗(yàn)中，植物材料的培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，不同位置（中央位置與周邊部分）植物所受的光照強(qiáng)度、溫度、濕度等因素略有差異。為了盡量避免其他因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，植物培養(yǎng)過程要適時(shí)調(diào)整植物幼苗在光照培養(yǎng)箱中的位置，消除“邊緣效應(yīng)”的影響。

（4）葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定的時(shí)間要求。葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定要充分考慮植物光合作用的規(guī)律，在植物光合作用活性較高的上午9：00–11：00時(shí)測定的熒光參數(shù)，才能最準(zhǔn)確地反映植物光合作用效率。

5 結(jié)語

葉綠素?zé)晒庾鳛楣夂献饔玫奶结槪玫搅藦V泛的研究和應(yīng)用。植物光合作用的所有變化過程均可通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化反映出來，而葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)采取原位測定的方法，不破壞植物體完整性，不損傷細(xì)胞。因此，通過研究葉綠素?zé)晒鈦黹g接研究光合作用的變化是一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的方法。

本文利用葉綠素?zé)晒鈨x的上述特點(diǎn)，結(jié)合植物生理學(xué)等課程的實(shí)驗(yàn)要求，設(shè)計(jì)了“利用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)研究不同溫度和水分條件對植物光合作用的影響”綜合實(shí)驗(yàn)。通過該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)施，既能夠使學(xué)生熟練掌握葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)，了解不同環(huán)境條件對葉綠素?zé)晒獾淖饔眯Ч帜軌驅(qū)崿F(xiàn)以學(xué)生自我訓(xùn)練為主的教學(xué)模式，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維能力、科學(xué)探究能力和實(shí)踐創(chuàng)新能力，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性、積極性和創(chuàng)造性，為今后自主開展科學(xué)研究工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)利用數(shù)字化的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，通過簡單的方法或技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)能夠獲得精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)及分析和整理數(shù)據(jù)的過程中，教師與學(xué)生形成互動(dòng)，現(xiàn)場解決疑難問題，能夠節(jié)省課堂學(xué)時(shí)，更好地闡述實(shí)驗(yàn)原理，提高課堂教學(xué)效率，是信息技術(shù)與生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)整合的新途徑。

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Application of chlorophyll fluorescence analysis technique in experimental teaching

BAN Yihui1, XU Zhouying2, LI Jing1, LI Yuan1, CHEN Bifeng1, LI Junli1, XIE Hao1

(1. School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China; 2. School of Civil Engineering and Architecture, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China)

Plant photosynthesis is an important research content of plant physiology and related courses, and chlorophyll fluorescence analysis technology is an important technical means to quickly and accurately detect plant physiological status. In this paper, a comprehensive design experiment project was designed to study the effects of different temperature and water conditions on plant photosynthesis by chlorophyll fluorescence analysis technology, and to study the effect of different temperature and water stress on plant photosynthesis characteristics. The implementation of this experimental project can familiarize students with the working principle of the modulated chlorophyll fluorescence meter and grasp the chlorophyll fluorescence analysis technology, so as to improve students’ ability to independently carry out scientific research projects, as well as their innovative consciousness and innovative ability.

chlorophyll fluorescence analysis technique; photosynthesis; temperature stress; water stress

G642.0

A

1002-4956(2019)09-0172-04

2019-02-21

武漢理工大學(xué)教學(xué)改革研究項(xiàng)目（w2018113，w2019121，w2019084）

班宜輝（1985—），男，河南商丘，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)橹参锟鼓鏅C(jī)制。

E-mail: banyihui@whut.edu.cn

徐舟影（1987—），女，安徽池州，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橹参?微生物共生機(jī)制。

E-mail: zhouyingxu@126.com

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.044