液相色譜-質譜聯用法測定血液中鄰苯二甲酸酯

宋小飛，施召才，馬偉文，銀玉容，史 偉

液相色譜-質譜聯用法測定血液中鄰苯二甲酸酯

宋小飛，施召才，馬偉文，銀玉容，史 偉

（華南理工大學 環境與能源學院廣東 廣州 510006）

研究了加速溶劑萃取（ASE）/液相色譜-質譜聯用技術測定血液中鄰苯二甲酸單酯。血液樣品經過冷凍干燥，利用加速溶劑萃取的方法，最后使用液相色譜-質譜儀分析檢測PAEs成分。該方法的回收率為72.1%~136%；檢出限為1.47~12.3 ng/L。通過對珠三角地區的成年男性采集的血液分析，發現除MBzP外，血液中其他m-PAEs的均有檢出。血液中?8m-PAEs的質量濃度為（26.1±57.3 ng/g）。血液中以MBP、MiBP、MEHP和MnOP為主，分別占血液中m-PAEs濃度的36.7%、23.2%、15.1%和13.2%。

快速溶劑萃取；液相色譜-質譜；鄰苯二甲酸酯

鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）是一類內分泌干擾物，具有類雌激素作用和抗雄激素作用，可干擾機體內分泌系統，導致生殖發育系統異常，并且具有一定的肝臟毒性和致癌作用[1-3]。PAEs 可通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑進入人體，并在體內發生代謝[4-6]。目前，PAEs人體內暴露評價普遍采用體內鄰苯二甲酸酯代謝物作為生物標志物，對人體中鄰苯二甲酸酯代謝物的研究將為PAEs的暴露評價提供重要信息[7]。

目前，環境中的PAEs含量分析方法比較多[8-19]，但是關于人體血液中的含量研究則相對較少。研究表明，PAEs作為環境內分泌干擾物，其對動物機體，尤其對于雄性個體具有生殖發育毒性和內分泌干擾作用，且具有致癌性和致突變性[20]。因此，建立一種簡單、快速測定人血液中的痕量的PAEs 的分析方法具有很重要的意義。本研究采用樣品冷凍干燥、ASE快速溶劑萃取的方式處理樣品，使用液相色譜-質譜聯用分析技術，檢測血液樣本中的8種鄰苯二甲酸單酯（mono-PAEs或m-PAEs），以分析珠三角地區成年男性血液中PAEs暴露水平。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

儀器：1200-QQQ6410B液體相色譜/質譜聯用儀（Agilent，美國）；ASE-150快速溶劑萃取儀（DIONEX，美國）；4KBTXL-75冷凍干燥機（VirTis，美國）；AD A10超純水儀（Millipore，美國）。

試劑：m-PAEs標準品：MMP、MEP、MBP、MiBP、MBzP、MHP、MEHP、MnOP（Aldrich，美國）；回收率指示物：D4-MnBP（Aldrich，美國）；甲醇、醋酸、正己烷和丙酮（色譜純，CNW，美國）；硅藻土（DIONEX， 美國）

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；ODS Hypersil預處理柱（2.1 mm×10 mm，5 μm）；流速：0.5 mL/min。流動相：體積分數為0.01%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）。流動相梯度：0~5 min 50%A；5~6 min 50%~40%A；6~12 min 40%A；12~12.5 min 40%~15%A；12.5~20 min 15%A；20~20.5 min 15%~50%A；20.5~25 min 50%A。柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL。

1.2.2 質譜條件

離子源電噴霧式離子源（electrospray ionization，ESI），負離子掃描模式；監測方式為多重反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源電壓（噴霧電壓）為–4000 V；干燥氣為氮氣，流速為9 mL/min，溫度350 ℃；霧化器壓力2.4′105Pa（35 Psi）；碰撞氣為氮氣。

1.3 樣品前處理

（1）冷凍干燥。采集的血液樣品保存于超低溫冰箱（–80 ℃）中，取出后拿下蓋子，用錫箔紙包好杯口，用針在錫箔紙上均勻扎孔；放入完成預冷的冷凍干燥機內進行冷凍干燥，干燥24 h，完成干燥后取出樣品，凍干率11.12%；保存于超低溫冰箱（–80 ℃），待分析。

（2）ASE萃取方法。準確稱取生物樣品于萃取池中，加入PAHs回收率指示物。ASE提取條件：第一步：溫度100 ℃，壓力1.034′107Pa（1 500 Psi），甲醇靜態提取1個循環，循環持續5 min，以池體積60%的溶劑量沖洗提取池，氮氣吹掃60 s；第二步：溫度100 ℃，壓力1.034′107Pa（1 500 Psi），正己烷-甲醇（體積比為1∶1）靜態提取3個循環，循環持續5 min；以池體積60%的溶劑量沖洗提取池，氮氣吹掃60 s；合并萃取液，洗脫液氮氣吹干，甲醇定容至500mL，LC-MS分析。

1.4 質量控制與保證（QA/QC）

在優化條件下，分別測定不同濃度的m-PAEs混合標準溶液的峰面積，采用外標法定量。以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，繪制標準曲線。以信噪比為3 時的對應濃度作為方法的檢出限（limit of detection，簡稱LOD），以信噪比為10 時的對應濃度作為方法的定量限（limit of quantification，簡稱 LOQ），根據低水平空白加標樣品6 次平行分析結果的標準偏差計算獲取m-PAEs 的方法相關系數，檢出限和定量限。

取一定量生物樣品，分別加入不同濃度的m-PAEs標準混合溶液以及相應量的回收率指示物，在確定的分析條件下，平行測定6次，計算m-PAEs及其m-PAEs回收率指示物的回收率與精密度。

2 結果與討論

2.1 m-PAEs特征離子和定量離子和總離子流色譜圖

m-PAEs對應的特征離子和定量離子見表1，m-PAEs標準溶液總離子流色譜圖見圖1。

表1 m-PAEs質譜分析條件

2.2 方法線性范圍、相關系數、檢出限和定量限

在確定的實驗條件下，方法線性范圍、相關系數、檢出限和定量限見表2。由表2可知，m-PAEs在0.01~250 ng/g范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.9996~0.9999；方法檢出限為1.47~12.3 ng/L，定量限為4.41~36.9 ng/L。

圖1 m-PAEs總離子流色譜圖

表2 m-PAEs方法的線性范圍和檢出限

2.3 方法回收率和精密度

加標回收率結果見表3。由表3可知，生物樣品中的m-PAEs的回收率在72.1%~136%之間，相對標準偏差2.05%~4.53%。

表3 m-PAEs方法的回收率

2.4 實際樣品分析檢測

2.4.1 珠江三角洲地區人群血液中m-PAEs的暴露水平

珠江三角洲地區人群血液中8種m-PAEs的質量濃度見表4，血液中?8m-PAEs的質量濃度為1.87 ng/g~551 ng/g，中值為13.2 ng/g，平均質量濃度為（26.1±57.3）ng/g。血液中除鄰苯二甲酸芐基酯（MBzP）外，MMP、MEP、MBP、MiBP、MHP、MEHP和MnOP都能被檢出。

表4 血液中m-PAEs濃度 ng×g-1

注：ND表示未測出.

2.4.2 珠江三角洲地區人群血液中m-PAEs的組成特征

珠江三角洲地區人群血液中m-PAEs的組成特征如圖2所示。由圖2可知，血液中除MBzP未檢出外，血液中MBP含量最高（36.7%）， MiBP次之（23.1%）， MEHP和MnOP的含量也較高。

圖2 血液中8種m-PAEs含量比例

3 結論

珠江三角洲地區人群血液中?8m-PAEs的質量濃度為1.87 ng/g~551 ng/g，中值為13.2 ng/g，平均濃度為（26.1 ± 57.3） ng/g；血液中以MBP、MiBP、MEHP、MnOP為主要m-PAEs，在血液中的含量分別為36.7%、23.2%、15.1%、13.2%。血液中MBP含量>MiBP含量> MEHP含量>MnOP含量>MMP含量>MEP含量> MHP含量，MBzP未檢出。

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Determination of phthalate esters in blood by liquid chromatography-mass spectrometry

SONG Xiaofei, SHI Zhaocai, MA Weiwen, YIN Yurong, SHI Wei

(School of Environment and Energy, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The determination of monophthalate in blood by accelerated solvent extraction (ASE)/liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) is studied. Blood samples are freeze-dried and extracted by accelerated solvent, and finally, PAEs are analyzed by the liquid chromatography-mass spectrometry. The recovery of this method is from 72.1% to 136%, and the detection limit is from 1.47 ng/L to 12.3 ng/L. Blood samples collected from adult males in the Pearl River Delta are analyzed, and it is found that all m-PAEs are detected except MBzP. The concentration of?8m-PAEs in blood is (26.1+57.3 ng/g). MBP, MiBP, MEHP and ManOP are the main components in blood, accounting for 36.7%, 23.2%, 15.1% and 13.2% of m-PAEs concentration respectively.

accelerated solvent extraction; liquid chromatography-mass spectrometry; phthalate esters

R331.1；0657.63

A

1002-4956(2019)09-0053-04

2019-01-08

廣東省自然科學基金項目（B6160760）

宋小飛（1980—）男，陜西西安，博士，高級實驗師，主要從事環境監測和環境健康研究。

施召才（1982—）男，廣東饒平，碩士，實驗師，研究方向為環境監測和健康研究。

E-mail: zcshi@scut.edu.cn

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.014