3種抗HBV核苷(酸)類似物體外抗乙肝病毒作用

龔紅菲，龐富華，芮 瑩，韋 歐，韋京辰

3種抗HBV核苷(酸)類似物體外抗乙肝病毒作用

龔紅菲，龐富華，芮 瑩，韋 歐，韋京辰

（桂林醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 桂林 541100）

比較3種抗HBV核苷（酸）類似物（拉米夫定、恩替卡韋、替諾福韋）對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞的毒性作用和對(duì)HBsAg、HBeAg和HBV-DNA表達(dá)的抑制效果。用四甲基噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒性；酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測(cè)HBsAg 和HBeAg表達(dá)水平；PCR-熒光探針法定量檢測(cè)HBV-DNA含量。結(jié)果：在最高濃度200 mg/L時(shí)，拉米夫定組存活率為74.72%，恩替卡韋組存活率僅為36.74%，替諾福韋組存活率為95.22%；拉米夫定和替諾福韋對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)無明顯抑制，恩替卡韋對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)有抑制并與其細(xì)胞毒性相一致。在第9天，3種藥物對(duì)HBV-DNA抑制作用明顯，在6.25 mg/L濃度時(shí)，抑制率均高于90%；3種藥物在相同藥物濃度下，恩替卡韋對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞毒性最大，替諾福韋幾乎沒有細(xì)胞毒性，拉米夫定有一定毒性。

抗HBV核苷（酸）類似物；細(xì)胞毒性；HBsAg；HBeAg；HBV-DNA

乙型肝炎病毒（HBV）是一種全球常見的血液傳播病原體，某些患者可引起肝硬化和肝癌，甚至死亡[1]。目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了兩類抗病毒藥物用于治療乙型肝炎，即免疫調(diào)節(jié)劑（干擾素[IFN]-a和聚乙二醇化干擾素[PEG-IFN]-a）和核苷（酸）類似物（拉米夫定，替比夫定，阿德福韋，替諾福韋[TDF]和恩替卡韋[ETV]）。盡管核苷類似物具有良好的耐受性并表現(xiàn)出早期和強(qiáng)效的抗病毒作用，但在長期治療期間耐藥突變株的出現(xiàn)和腎毒性限制了其藥物的使用[2-4]。干擾素和核苷酸停藥后，往往又會(huì)檢測(cè)到HBV-DNA，即所謂的“反跳現(xiàn)象”[5]，這使得研究新型的抗乙肝病毒藥物顯得尤其重要。

目前，抗HBV治療缺乏特效藥，臨床常用的藥物對(duì)HbsAg、HbeAg和HBV-DNA僅有部分抑制作用，或抑制作用不強(qiáng)，抗乙肝病毒藥物研究具有很好的前景[6]。在抗HBV體外實(shí)驗(yàn)中，陽性藥物的選擇和藥物濃度設(shè)定雜亂且效果參差不齊，缺乏可參照性。本文用臨床上抗HBV療效較好的3種核苷（酸）類似物體進(jìn)行體外抗HBV實(shí)驗(yàn)，摸索不同藥物濃度下其對(duì)抗原及HBV-DNA的抑制效果，為抗HBV藥物研究實(shí)驗(yàn)中陽性藥的選擇和濃度設(shè)定提供參考。

1 材料

細(xì)胞株：HepG 2.2.15細(xì)胞由中國人民解放軍第302醫(yī)院提供，本室定期用G418篩選。

藥物與試劑：拉米夫定、恩替卡韋和替諾福韋(上海源葉)，G418（Gibco），DMEM（Gibco），胎牛血清（浙江天杭），青霉素-鏈霉素混合液（NOVON），胰蛋白酶-EDTA消化酶（Solarbio），PBS（Solarbio），HBsAg，HBeAg試劑盒（上海科華），乙型肝炎病毒核酸測(cè)定試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因）。

2 儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱（SANYO），超凈工作臺(tái)（天津市塵埃凈化設(shè)備廠），倒置顯微鏡（上海蔡康），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（BioTek），熒光定量PCR儀（基因有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning）,96孔板（Corning）。

3 方法

3.1 3種抗HBV核苷（酸）類似物的配置

將拉米夫定、恩替卡韋、替諾福韋溶于DMSO后加入無血清DMEM培養(yǎng)液，混勻，配制成2 mg/L培養(yǎng)液；用含10% DMSO的DMEM培養(yǎng)液按梯度稀釋法，稀釋成質(zhì)量濃度為1000、500、250、125、62.5 mg/L的樣品溶液。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG 2.2.15細(xì)胞以1×104/mL接種于96孔板，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁且狀態(tài)良好，去除原有培養(yǎng)基，加入180 μL完全培養(yǎng)基，再加入20 μL上述藥物稀釋液（藥物終質(zhì)量濃度為200、100、50、25、12.5、6.25 mg/L），每3 d更換相同培養(yǎng)基和藥液。同時(shí)設(shè)置無藥物的陰性對(duì)照組，收集上清液置–20 ℃保存待測(cè)。

3.3 四甲基噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞毒性

第9天收集上清后，96孔板中每孔加入完全培養(yǎng)基100 μL和20 μL MTT，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，去除上清，加入100 μL DMSO，置搖床輕輕振蕩10~15 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處讀取吸光度OD值，根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%

3.4 酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測(cè)HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制率

將第3、6、9天的上清液按HBsAg和HBeAg試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀在450 nm讀取吸光度OD值，根據(jù)以下公式計(jì)算HBsAg和HBeAg的抑制率：

抑制率/%=[（對(duì)照組平均OD值–實(shí)驗(yàn)組平均OD值）÷對(duì)照組平均OD值]×100%

3.5 PCR-熒光定量法定量檢測(cè)HBV-DNA

將第3、6、9天的上清液根據(jù)乙型肝炎病毒核酸測(cè)定試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書步驟操作，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其熒光信號(hào)，依據(jù)預(yù)循環(huán)值（q值）實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定量檢測(cè)。

3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，OD值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉ±s）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞毒性

MTT結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比較，在最高質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，拉米夫定組存活率為74.72%，恩替卡韋組存活率僅為36.74%，替諾福韋組存活率為95.22%，3種藥物在相同藥物濃度下，恩替卡韋 對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞毒性最大，而替諾福韋幾乎沒有細(xì)胞毒性；拉米夫定有一定毒性，介于二者之間，詳見 表1。

表1 3種抗HBV核苷（酸）類似物對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞的毒性作用

注：*者表示與陰性對(duì)照組比較<0.05。

4.2 對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制

與陰性對(duì)照組相比，拉米夫定及替諾福韋對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞的HBsAg、HBeAg表達(dá)無明顯抑制；恩替卡韋對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)有抑制，并與其細(xì)胞毒性相一致，且呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性和濃度依賴性抑制，在第9天達(dá)到峰值，詳見表2和表3。

表2 3種抗HBV核苷（酸）類似物對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞HBsAg表達(dá)的影響

注：*者表示與陰性對(duì)照組比較<0.05。

表3 3種抗HBV核苷（酸）類似物對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞HBeAg表達(dá)的影響

注：*者表示與陰性對(duì)照組比較<0.05。

4.3 對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞HBV-DNA表達(dá)的抑制

從表4可知，3種抗HBV核苷（酸）類似物（拉米夫定、恩替卡韋、替諾福韋）在設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，均有良好的體外抑制HBV-DNA作用，在第9天，在6.25 mg/L濃度時(shí)抑制率均高于90%。

表4 3種抗HBV核苷（酸）類似物對(duì)HBV-DNA 的抑制作用

注：*者表示與陰性對(duì)照組比較<0.05。

5 討論

核苷（酸）類似物主要通過抑制病毒的反轉(zhuǎn)錄和DNA合成發(fā)揮抗病毒作用。拉米夫定通過抑制HBV-DNA多聚酶活性來治療乙型肝炎病毒[7]，而對(duì)病毒mRNA無作用, 為中國臨床上抗乙肝的一線藥物[8]。恩替卡韋是繼拉米夫定后的第二個(gè)獲得批準(zhǔn)上市并用于治療慢性乙型肝炎的核苷類似物，對(duì)于初治患者及拉米夫定治療失效患者均具有明顯的抗HBV作用[9]。替諾福韋是替諾福韋-5-單磷酸腺苷類似物脂類的前體藥，該藥作用機(jī)理和恩替卡韋是一致的，均是進(jìn)入人體后被體內(nèi)細(xì)胞激酶磷酸化，之后生成替諾福韋二磷酸而發(fā)揮其藥效，二磷酸能夠與體內(nèi)5-三磷酸脫氧腺苷酸競(jìng)爭(zhēng)性參與乙肝病毒的合成，其抗HBV活性良好，并具有顯著的基因屏障作用[10-12]。

本研究中，在相同的藥物濃度下，恩替卡韋對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞毒性最大，替諾福韋幾乎沒有細(xì)胞毒性，拉米夫定有一定毒性。在細(xì)胞存活率大于70%時(shí)，3種藥物對(duì)HBsAg和HBeAg表達(dá)無明顯抑制作用，均通過抑制HBV-DNA復(fù)制來治療乙型肝炎病毒。因此，在抗HBV體外實(shí)驗(yàn)中，如果選擇拉米夫定和替諾福韋作為陽性藥，因其對(duì)細(xì)胞的增殖影響不大，且在6.25 mg/L時(shí)對(duì)HBV DNA仍有很強(qiáng)抑制作用，可選擇的濃度范圍比較廣；而恩替卡韋對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用比較強(qiáng)，質(zhì)量濃度為6.25 mg/L時(shí)對(duì)細(xì)胞抑制為76.48%，增加濃度則對(duì)細(xì)胞抑制更明顯。為避免出現(xiàn)抑制細(xì)胞而抑制DNA表達(dá)的現(xiàn)象出現(xiàn)，影響科研實(shí)驗(yàn)的對(duì)比，選擇恩替卡韋作為陽性藥時(shí)，藥物質(zhì)量濃度設(shè)定低于6.25 mg/L更為合理。用HepG 2.2.15細(xì)胞進(jìn)行體外抗HBV實(shí)驗(yàn)，應(yīng)結(jié)合藥物對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞的毒性作用，在不影響細(xì)胞增殖同時(shí)又能抑制HBsAg、HBeAg或HBV DNA表達(dá)，陽性藥設(shè)定合適的藥物濃度范圍更具有可比性和科學(xué)性。

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Effect of three anti-HBV nucleoside (acid) analogues on hepatitis B virus in vitro

GONG Hongfei, PANG Fuhua, RUI Ying, WEI Ou, WEI Jingchen

(College of Pharmacy, Guilin Medical University, Guilin 541100, China)

The comparison on the toxicity of three anti-HBV nucleoside (acid) analogues (lamivudine, entecavir and tenofovir) on HepG 2.2.15 cells and their inhibitory effects on the expression of HBsAg, HBeAg and HBV-DNA is carried out Tetramethylthiazole blue (MTT) assay is used to detect the cytotoxicity of drugs, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is adopted to detect the expression level of HBsAg and HBeAg, and quantitative detection of HBV-DNA content by PCR-fluorescence probe is conducted. The results are that at the highest concentration of 200 mg/L, the survival rate of lamivudine group is 74.72%, the survival rate of entecavir group is 36.74%, and the survival rate of tenofovir group is 95.22%. Lamivudine and tenofovir don’t inhibit the expression of HBsAg and HBeAg, but entecavir has inhibited the expression of HBsAg and HBeAg, which is consistent with their cytotoxicity. In the 9th day of PCR experiment, the inhibition of HBV-DNA by three drugs is obvious, and at 6.25 mg/L concentration, the inhibition rate is higher than 90%. Under the same concentration of three drugs, entecavir has the greatest cytotoxicity to HepG 2.2.15, tenofovir had almost no cytotoxicity, lamivudine had certain toxicity.

anti-HBV nucleoside (acid) analogues; cytotoxicity; HBsAg; HBeAg; HBV-DNA

R965.1

A

1002-4956(2019)09-0045-04

2019-02-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81560574）資助

龔紅菲（1993—），女，廣西興業(yè)，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榭鼓[瘤抗病毒藥理。

E-mail: 850699627@qq.com

韋京辰（1976—），女，廣西桂林，碩士，副教授，研究方向?yàn)榭鼓[瘤抗病毒藥理研究。

E-mail: 82579354@qq.com

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.012