酸敏感離子通道1a在酸誘導的大鼠膝關節滑膜成纖維細胞自噬中的作用及其機制研究

陳霖　王新亮

【摘要】 目的：探討酸敏感離子通道1a（ASIC1a）在酸誘導的大鼠膝關節滑膜成纖維細胞（SFs）自噬中的作用和機制。方法：分離大鼠膝關節SFs，在不同胞外酸化條件處理后檢測軟骨自噬蛋白（LC3-Ⅱ）的表達。觀察ASIC1a阻斷劑對自噬小體數量、自噬基因（Beclin-1）mRNA的表達，自噬相關蛋白（RRK1/2、p38MAPK）磷酸化的影響;觀察RRK1/2、p38MAPK磷酸化抑制劑對Beclin-1 mRNA、LC3-Ⅱ蛋白表達的影響。結果：HE染色結果證實符合SFs的特征;pH 7.4組LC3-Ⅱ蛋白表達0.05），其余每兩組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;pH 7.4組細胞器完整且形態規則，pH 6.0組可見線粒體腫脹，且雙層膜包裹的細胞自噬小體較多，pH 6.0+Amiloride組細胞質自噬小體數量稍少，細胞器形態有所恢復，pH 6.0+PcTX1組細胞質自噬小體數量更高，細胞器接近正常;pH 7.4組Beclin-1 mRNA表達0.05），其余每兩組間對比，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：胞外酸化條件可誘導大鼠膝關節SFs自噬，阻斷ASIC1a能明顯弱化此作用，且特異性阻斷劑的效果更佳，其機制可能與調控Beclin-1基因表達，抑制ERK1/2磷酸化有關。

【關鍵詞】 酸敏感離子通道1a; 膝關節炎; 滑膜成纖維細胞; 自噬; 機制

Study on the Role and Mechanism of Acid-sensitive Ion Channel 1a in Acid-induced Autophagy of Synovial Fibroblasts of Knee Joint in Rats/CHEN Lin，WANG Xinliang.//Medical Innovation of China，2019，16（20）：0-027

【Abstract】 Objective：To investigate the role of acid-sensitive ion channel 1a（ASIC1a）in acid-induced autophagy of rat knee synovial fibroblasts（SFs）and its mechanism.Method：Rat knee joints SFs were separated，the expression of cartilage autophagy protein（LC3-Ⅱ）was detected under different extracellular acidification conditions.The effects of ASIC1a blockers on the number of autophagy bodies，the expression of autophagy gene（Beclin-1）mRNA and the phosphorylation of autophagy associated protein（RRK1/2，p38MAPK）were observed;the effect of RRK1/2，p38MAPK phosphorylation inhibitor on the expression of Beclin-1 mRNA，LC3-Ⅱ protein was observed.Result：The results of HE staining showed that it was consistent with the characteristics of SFs cells.The expression of LC3-Ⅱ protein in pH 7.4 group < pH 7.0 group < pH 6.5 group < pH 6.0 group/pH 5.5 group，there was no significant difference between the pH 6.0 group and the pH 5.5 group（P>0.05），but there were significant differences between the other each two groups（P<0.05）.The organelle of pH 7.4 group was intact and regular in morphology，mitochondrial swelling was observed in the pH 6.0 group，and the number of autophagosomes encapsulated by bilayer membrane was more.The number of cytoplasmic autophagosomes in the pH 6.0 + Amiloride group was slightly less，and the organelle morphology was restored.The number of cytoplasmic autophagosomes in the pH 6.0 + PcTX1 group was higher，and the organelles were close to normal.The expression of Beclin-1 mRNA in pH 7.4 group < pH 6.0 PcTX1 group < pH 6.0 Amiloride group < pH 6.0 group，and there were significant differences between the two groups（P<0.05）.ERK1/2，p38MAPK phosphorylation levels in pH 7.4 group < pH 6.0 PcTX1 group < pH 6.0 Amiloride group < pH 6.0 group，and there were significant differences between the two groups（P<0.05）.Expressions of Beclin-1 mRNA and LC3-Ⅱ protein in pH 7.4 group < pH 6.0 + PD98059 group < pH 6.0 + PcTX1 group < pH 6.0 + SB203580 group/pH 6.0 group，and there was no significant difference in the expressions of Beclin-1 mRNA and LC3-Ⅱ protein between the pH 6.0 + SB203580 group and the pH 6.0 group（P>0.05），but there were significant differences between the other each two groups（P<0.05）.Conclusion：Extracellular acidification conditions can induce autophagy of SFs in rat knee synovium，blocking ASIC1a can significantly weaken this effect，and the effect of specific blockers is better，the mechanism may be related to regulating Beclin-1 gene expression and inhibiting ERK1/2 phosphorylation.

【Key words】 Acid-sensitive ion channel 1a; Knee arthritis; Synovial fibroblasts; Autophagy; Mechanisms

First-authors address：Guangzhou First Peoples Hospital，Guangzhou 510180，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.20.006

類風濕關節炎是臨床常見的自身免疫性疾病，呈全身性發展，以慢性多關節炎癥為主要臨床表現[1]。膝關節滑膜成纖維細胞（SFs）自噬是軟骨破壞的基礎病因，而骨質破壞則是致殘的重要原因，因此探討膝關節SFs自噬的機制意義重大[2-3]。酸敏感離子通道1a（ASIC1a）屬于上皮Na+通道/退化蛋白超家族成員，有研究證實其在大鼠膝關節炎關節軟骨破壞中有積極作用[4]。在類風濕關節炎患者中，膝關節軟骨常呈進行性加重性受損，推測可以通過抑制膝關節SFs自噬抑制軟骨破壞。在類風濕關節炎患者中，膝關節軟骨常呈進行性加重性受損，推測可以通過抑制膝關節SFs自噬抑制軟骨破壞。因此本研究特設計離體實驗，首先探討合適的胞外酸化條件，然后重點分析ASIC1a在酸誘導的大鼠膝關節SFs自噬中的作用及機制，以期為類風濕關節炎新藥的研發提供思路和方向。現將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 成年雄性SD大鼠20只，SPF級，7周齡，體質量180～200 g，購自河南省實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（豫）20160001。

1.2 方法

1.2.1 大鼠膝關節SFs分離、培養與鑒定 Ⅱ型膠原酶消化法分離大鼠膝關節，常規進行細胞培養，對第3代細胞進行HE染色鑒定。

1.2.2 不同胞外酸化條件細胞自噬蛋白（LC3-Ⅱ）的表達檢測 設置pH 7.4組、pH 7.0組、pH 6.5組、pH 6.0組、pH 5.5組（每組5個樣本），培養30 min后分別加入pH為6.0的培養基共培養3 h。以Western blot檢測LC3-Ⅱ表達。

1.2.3 不同干預方法自噬小體數量變化檢測 設置pH 7.4組、pH 6.0組、pH 6.0+Amiloride組、pH 6.0+PcTX1組（每組5個樣本），其中Amiloride濃度為100 μmol/L，PcTX1濃度為100 μg/L，于給藥

30 min后加入pH為6.0的培養基共培養3 h。常規接種、培養、消化并離心分離。固定后以梯度丙酮脫水，包埋，聚合。切片后染色并以透射電鏡觀察。

1.2.4 不同干預方法自噬基因（Beclin-1）mRNA的表達檢測 組別設置、干預和操作方法均參照1.2.3。采用聚合酶鏈反應（PCR）法檢測Beclin-1 mRNA，提取總核糖核酸（RNA），測定其含量、純度和完整性后進行擴增反應，反應條件：94 ℃（5 min）→94 ℃（40 s）→51 ℃（40 s）→72 ℃（1 min），35個循環，72 ℃（10 min）。電泳后以凝膠成像系統分析。

1.2.5 不同干預方法自噬相關蛋白（ERK1/2、p38MAPK）磷酸化水平檢測 組別設置、干預方法均參照1.2.3。以Western blot檢測ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平，操作方法參照1.2.2。

1.2.6 不同干預方法Beclin-1 mRNA、LC3-Ⅱ蛋白表達檢測 設置pH 7.4組、pH 6.0組、pH 6.0+PcTX1組、pH 6.0+PD98059組、pH 6.0+SB203580組（每組5個樣本），干預30 min后加入pH為6.0的培養基共培養3 h，參照1.2.4檢測Beclin-1 mRNA表達，參照1.2.2檢測LC3-Ⅱ蛋白表達。

1.3 統計學處理 采用SPSS 25.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，以SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SFs鑒定結果 HE染色結果顯示細胞多呈長梭形，核大且呈橢圓形，靠近胞質的中央，細胞呈漩渦樣或平行樣排列，集落性生長，符合SFs細胞的特征，見圖1。

2.2 不同胞外酸化條件下LC3-Ⅱ蛋白表達對

比 pH 7.4組、pH 7.0組、pH 6.5組、pH 6.0組、pH 5.5組的LC3-Ⅱ蛋白表達分別為（0.15±0.03）、（0.26±0.06）、（0.59±0.12）、（0.98±0.15）、（0.96±0.13），差異有統計學意義（F=67.538，P=0.000），且pH 7.4組LC3-Ⅱ蛋白表達0.05），其余每兩組間對比差異均有統計學意義（P<0.05），見圖2。

2.3 不同干預措施組間自噬小體數量對比 透射電鏡觀察結果顯示，pH 7.4組細胞器完整且形態規則（圖3a），pH 6.0組可見線粒體腫脹，且雙層膜包裹的細胞自噬小體較多（圖3b），pH 6.0+Amiloride組細胞質自噬小體數量稍少，細胞器形態有所恢復（圖3c），pH 6.0+PcTX1組細胞質自噬小體數量更高，細胞器接近正常（圖3d）。

2.4 不同干預措施組間Beclin-1 mRNA表達對比 pH 7.4組、pH 6.0組、pH 6.0+Amiloride組、

pH 6.0+PcTX1組Beclin-1 mRNA表達分別為（0.75±0.13）、（1.25±0.18）、（0.99±0.15）、（0.85±0.11），各組Beclin-1 mRNA表達對比差異有統計學意義（F=11.220，P=0.000），其中pH 7.4組

2.5 不同干預措施組間ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平對比 各組ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平對比，差異均有統計學意義（P<0.05），其中pH 7.4組

2.6 不同干預措施組間Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達對比 各組Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達對比，差異均有統計學意義（P<0.05），pH 7.4組0.05），且其余每兩組間對比差異均有統計學意義（P<0.05），見表2和圖5。

3 討論

本研究HE染色結果顯示所取細胞經分離和培養，生長為特征明顯的SFs，多呈長梭形，表現為集落性生長，為后續實驗的順利進行奠定了基礎。在不同胞外酸化條件干預后，各組LC3-Ⅱ蛋白表達呈明顯異常，pH 5.5～7.0組中其表達水平均明顯高于pH 7.4組，可知胞外酸化處理可增強LC3-Ⅱ蛋白表達。LC3-Ⅱ蛋白為細胞自噬的標志性蛋白，在細胞自噬過程中存在相關的翻譯后修飾，在自噬發生過程中該蛋白可在合成后隨即被Atg4剪切掉羧基端，并經相關生物學過程的加工和處理，參與推進細胞自噬進程[5-6]。由此可知pH 5.5～7.0胞外酸化條件均可促進SFs細胞自噬，而pH 6.0組和pH 5.5組中LC3-Ⅱ蛋白表達均明顯高于其余各組，可知其對SFs細胞自噬的促進作用更強，故本研究后續實驗選擇pH 6.0組作為酸化處理組。

此外，在不同干預措施處理后，pH 7.4組未見自噬小體，pH 6.0組自噬小體明顯可見，加入ASIC1a阻斷劑處理的兩組細胞器狀態明顯優于pH 6.0組，且自噬小體明顯少于pH 6.0組，而加入PcTX1組的透射電鏡下觀察的結果與pH 7.4組最為接近，可知給予ASIC1a阻斷劑干預可減輕胞外酸化所致的大鼠膝關節SFs自噬情況，且PcTX1的作用明顯優于Amiloride。ASIC1a屬于鈣滲透性酸敏感離子通道，胞外酸化可介導其開放通道，進而促進鈣離子內流，導致細胞內外鈣離子失衡，從而可引發一系列生物學效應，包括細胞自噬，因而胞外酸化可促進細胞自噬，而經過ASIC1a阻斷劑干預后，即使在酸化條件下，鈣離子通道的開放仍受抑制，鈣離子內流受阻，因此細胞自噬可得到控制，且ASIC1a特異性阻斷劑的作用更佳[7-9]。另外，不同干預措施Beclin-1 mRNA表達、ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平對比結果可知，pH 7.4組

在本研究進一步的對比結果中顯示，不同干預措施組間Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達有明顯差異，其中pH 7.4組最低，pH 6.0組最高，證實胞外酸化環境可上調Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達，促進大鼠膝關節SFs自噬;而pH 6.0+PD98059組中Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達明顯低于除pH 7.4外的其余三組，pH 6.0+SB203580組中Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達則與pH 6.0組相近，表明在胞外酸化條件下加入p38MAPK磷酸化阻斷劑并不會顯著影響Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達，而加入ERK1/2磷酸化阻斷劑則可顯著抑制Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達，意味著胞外酸化環境所致的大鼠膝關節SFs自噬可得到顯著控制，推測抑制ERK1/2磷酸化水平可減輕胞外酸化所致的SFs自噬，而在胞外酸化干預大鼠膝關節SFs自噬的過程中加入ASIC1a阻斷劑很可能是通過抑制ERK1/2磷酸化實現弱化細胞自噬的作用的。

綜上所述，胞外酸化條件可誘導大鼠膝關節SFs自噬，給予ASIC1a非特異性和特異性阻斷劑均能夠弱化此作用，且ASIC1a特異性阻斷劑PcTX1的作用更強，Beclin-1基因表達可顯著下調，ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平也可得到顯著控制;在胞外酸化條件下加入ERK1/2磷酸化阻斷劑可有效抑制細胞自噬，因此推測上述作用是通過抑制Beclin-1基因表達，控制ERK1/2磷酸化水平實現的。本研究提示ASIC1a特異性阻斷劑PcTX1、ERK1/2磷酸化阻斷劑均可抑制胞外酸化所致的膝關節SFs自噬，為類風濕性關節炎患者新藥的研發指明了方向，而其在人類中應用的可行性、有效性和安全性均需更深入觀察探討，應作為未來的研究方向。

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