精子DNA碎片、彈性硬蛋白酶及精液參數與孕早期流產相關性的前瞻性研究

張俊　鐘誠　查錢江

【摘要】 目的：探討孕早期流產是否與精子DNA碎片化指數（DFI）、精漿彈性硬蛋白酶、精子形態、精子動力學參數有關。方法：選取2016年12月-2019年2月于本院生殖中心行人工授精（IUI）或體外受精胚胎移植（IVF-ET）的男性患者120例，根據術后配偶妊娠情況，將其分為IUI分娩組、IUI流產組、IVF分娩組、IVF流產組，各30例。比較各組精子濃度、前向運動精子百分率、精子形態學檢查結果、精漿彈性硬蛋白酶、精子DFI。結果：IUI流產組和IUI分娩組精子濃度、前向運動精子百分率、正常形態精子百分率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;IVF流產組和IVF分娩組精子濃度、前向運動精子百分率、正常形態精子百分率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;IUI流產組、IVF流產組精漿彈性硬蛋白酶及精子DFI均分別高于IUI分娩組、IVF分娩組，差異均有統計學意義（P<0.05）。

結論：孕早期流產與精漿彈性硬蛋白酶、精子DFI高有關，與精子濃度、前向運動精子百分率、正常形態精子百分率無關。

【關鍵詞】 孕早期流產; 精子DNA碎片化指數; 彈性硬蛋白酶

Prospective Study on the Relationship between Sperm DNA Fragments，Elastoproteinase and Semen Parameters and Early Pregnancy Abortion/ZHANG Jun，ZHONG Cheng，ZHA Qianjiang.//Medical Innovation of China，2019，16（20）：0-018

【Abstract】 Objective：To explore whether early pregnancy abortion is related to sperm DNA fragmentation index（DFI），seminal plasma elastoproteinase，sperm morphology and sperm dynamics parameters.Method：A total of 120 male patients undergoing artificial insemination（IUI）or in vitro fertilization and embryo transfer（IVF-ET）in the reproductive center of our hospital from December 2016 to February 2019 were selected.According to the pregnancies of spouses after operation，they were divided into IUI delivery group，IUI abortion group，IVF delivery group and IVF abortion group，30 cases in each group.The sperm concentration，forward motility sperm rate，sperm morphology，seminal plasma elastoproteinase and sperm DFI in four groups were compared.

Result：There were no significant differences between IUI abortion group and IUI delivery group in sperm concentration，forward motility sperm rate and normal morphology sperm percentage（P>0.05）.There were no significant difference between IVF abortion group and IVF delivery group in sperm concentration，forward motility sperm rate and normal morphology sperm percentage（P>0.05）.The seminal plasma elastoproteinase and sperm DFI in IUI abortion group and IVF abortion group were higher than those of IUI delivery group and IVF delivery group respectively，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Early pregnancy abortion is associated with high seminal plasma elastoproteinase and sperm DFI，but not with sperm concentration，sperm motility and normal sperm percentage.

【Key words】 Early pregnancy abortion; Sperm DNA fragmentation index; Elastoproteinase

First-authors address：Central Peoples Hospital of Huizhou，Huizhou 516001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.20.004

復發性流產是育齡婦女的常見病[1]。目前復發性流產的病因研究主要集中在女性，而對于男性因素的研究很少[2-3]。但是精子因素與胚胎質量密切相關，男性因素與流產的內在聯系目前不是很清楚，值得深入研究[4]。本研究試圖通過比較人工授精（IUI）、體外受精胚胎移植（IVF-ET）兩種不同助孕方式后正常分娩組與配偶孕早期流產組的男性相關指標，分析孕早期流產是否與精子DNA碎片化指數（DFI）、精漿彈性硬蛋白酶、精子形態、精子動力學參數有關。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年12月-2019年2月于本院生殖中心行IUI或IVF-ET的男性患者120例，平均年齡（35.2±2.8）歲。納入標準：20～40歲男性;配偶體健;以男方因素行IUI或IVF者。排除標準：先天性生殖系統發育畸形、內分泌異常、染色體異常、精索靜脈曲張，或近6個月內有高熱史、泌尿生殖道急性感染者;配偶懷孕后因外力因素導致流產者。根據術后配偶妊娠情況，將其分為IUI分娩組（IUI術后配偶正常分娩）、IUI流產組（IUI術后配偶孕早期自然流產）、IVF分娩組（IVF-ET術后配偶正常分娩）、IVF流產組（IVF-ET術后配偶孕早期自然流產），各30例。本研究已經醫院倫理學委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 精液參數檢測 患者留取標本前禁欲2～7 d，參照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊（第5版）》的標準，檢測精液體積、pH值、濃度、前向運動精子率;精子形態學檢測采用改良巴氏染色法，嚴格按標準評估精子的形態。

1.2.2 精漿彈性硬蛋白酶濃度測定 新鮮標本液化后立即取部分標本3 000 g離心15 min，留取精漿用Eppendorf管分裝數支后，-20 ℃保存。使用精漿彈性硬蛋白酶定量檢測試劑盒（深圳市博銳德生物科技有限公司），按常規流程檢測精漿彈性硬蛋白酶。

1.2.3 精子DFI檢測 采用精子染色質擴散（SCD）法，使用Halosperm試劑盒（Halotech公司）。按照常規流程操作，在高倍光鏡下觀察500個精子，根據Fernandez標準分級，大暈環和中暈環表示精子DNA完整無損傷，小暈環、無暈環、退化精子表示精子DNA損傷。DFI=DNA損傷精子數/精子總數×100%。

1.3 觀察指標 觀察并比較各組精子濃度、前向運動精子百分率、精子形態學檢查結果、精漿彈性硬蛋白酶、精子DFI。

1.4 統計學處理 使用SPSS 24.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用F檢驗，兩組間比較采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組一般資料比較 IUI分娩組、IUI流產組、IVF分娩組、IVF流產組平均年齡分別為（35.8±3.1）、（36.2±3.3）、（34.4±3.2）、（25.1±2.1）歲，組間比較，差異無統計學意義（F=3.018，P>0.05）。

2.2 四組精液參數比較 IUI流產組和IUI分娩組精子濃度、前向運動精子百分率、正常形態精子百分率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;IVF流產組和IVF分娩組精子濃度、前向運動精子百分率、正常形態精子百分率比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1、2。

2.3 四組精漿彈性硬蛋白酶的檢測結果比較 IUI流產組、IVF流產組精漿彈性硬蛋白酶及精子DFI均分別高于IUI分娩組、IVF分娩組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3、4。

3 討論

在過去數十年的調查中，健康男性的精液質量，包括精液含量、精子濃度及活動力和形態正常精子比例都逐漸惡化，且精子濃度平均每年降低2.1%，顯見男性精液質量逐漸惡化中。生活習慣、環境、生理狀態及基因都會影響精子功能，進而造成男性不育[3]。目前治療不孕癥的患者，臨床使用的方法即IUI或IVF-ET，使患者達到受孕的目的。然而，精子質量的好壞會直接影響到體外受精的成功率，因此，最根本的方法即為提升男性精子質量。精子的細胞膜上富含多元不飽和脂肪酸，容易受氧化物質（ROS）攻擊而脂質過氧化，使脂質氧化產物-丙二醛升高及DNA受損，且使前向運動精子率衰退，ATP生成下降，線粒體膜電位降低，進而使精子與卵結合能力下降。

精卵結合形成胚胎，胚胎的質量不僅與卵子相關，也與精子質量密切相關[5-6]。從理論上推測，流產與精子質量存在密不可分的關系。精液常規分析是男性不育患者常用的檢查項目，但有其局限性，僅能從宏觀上判斷精子的理化特征，很難從分子生物水平上反映精子的質量和精漿的異常變化，因此急需找到其他的檢測指標來輔助判斷精液的質量，判斷精液與流產的關系。

精子染色體雖然被魚精蛋白緊密包裹，但仍然不能避免DNA受到不良影響。精子的DNA攜帶著重要的遺傳信息，在漫長的生成和成熟過程中，在很多不良因素的影響下，均可能發生DNA損傷[7-10]。

比如外部暴露、年齡老化、電離輻射、空氣污染及其他環境暴露均已被證實可能導致精子DNA碎片增加，而是否會進一步影響妊娠結局，是否與胚胎丟失率有關成了近期的熱點論題[11-17]。本研究結果顯示，IUI流產組、IVF流產組精子DFI均分別高于IUI分娩組、IVF分娩組，差異均有統計學意義（P<0.05），證實了上述結論，其機制可能與DNA損傷后，引起某些蛋白合成不足，或某些遺傳物質穩定性下降有關，需要在以后的研究中進一步闡明。

彈性硬蛋白酶分布于中性粒細胞、巨噬細胞等細胞和組織中，其濃度與炎性細胞數呈正比，可作為靜止型生殖道感染的診斷及愈后檢測指標[18]，臨床上主要用于檢查男性生殖道感染，根據檢測試劑不同，其參考范圍有所不同，濃度越高，感染越嚴重。當生殖道感染時，炎性細胞可通過吞噬、產生活性氧及分泌多種細胞因子等方式損傷精子，造成精子成熟和精子功能障礙，甚至成為胚胎質量的潛在隱患，可能與流產等不良妊娠結局有關系[19-20]，為生殖道感染的敏感性指標。本研究結果顯示，IUI流產組、IVF流產組精漿彈性硬蛋白酶均分別高于IUI分娩組、IVF分娩組，差異均有統計學意義（P<0.05），證實了上述結論，但尚需在以后的工作中，結合細菌培養等微生物學檢測指標進一步明確其具體機制。

以往關于男性因素與流產的相關性研究中，大都是配偶流產后，再檢測男性精子相關指標，此時的精液質量無法代表精卵結合前的精子質量。本研究采用隨機對照的研究方法，所有病例都完整收集了從初診到進入IUI或IVF助孕周期的檢測結果，記錄了隨訪的妊娠結局。與以往研究不同的是，本研究在IUI、IVF-ET的術前，已經對患者的精液質量做了詳細的檢測并詳細記錄，而這些在精卵結合之前做的精液相關檢測數據與最終的妊娠結局是密切相關的。

綜上所述，筆者考慮孕早期流產與精漿彈性硬蛋白酶、精子DFI高有關，與精子濃度、前向運動精子百分率、正常形態精子百分率無關。

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