豬苓多糖脂質體的制備及表征

韓悅 李早慧 趙欣宇 黃禮祥 范靖琪

摘要：目的：旨在通過薄膜分散法-微孔濾膜擠壓法制備脂質體，并對脂質體包封率、粒度分布、zeta電位進行檢測。方法：主要通過單因素試驗及正交試驗篩選出最佳的制備工藝，且驗證工藝的合理。脂質體利用薄膜分散法制備并測定包封率，考察脂質體的形態。結果：所制備出的豬苓多糖脂質體包封率較高，粒徑均勻，顯微鏡下脂質體均勻圓整、近球形。

關鍵詞：豬苓多糖;薄膜分散法;包封率

基金項目：吉林省大學生科技創新省級，項目號：2018012

中圖分類號： TQ461 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼： ?A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.16.038

豬苓已有2000多年藥用歷史，是我國比較常用的菌類藥材，在《神農本草經》等著作中都體現了其應用價值[1]。近些年研究發現，從中藥材豬苓中分離出來的豬苓多糖，為植物型的免疫增強劑。可以有效地促進肝細胞再生和肝功能恢復，針對慢性乙型肝炎可促進表面抗體的產生，具有顯著的治療效果[2]。目前市面上常見的豬苓多糖劑型為膠囊劑及顆粒劑。這些傳統劑型雖然有一定療效，但在血液中停留時間短，藥效低。

20世紀70年代首次將脂質體作為藥物載體應用[3]，脂質體的結構使其具有靶向作用，可選擇性地作用于細胞[4]，并具有低毒性和長效緩釋性，引起了廣大藥劑學者的關注與研究[5、6]。

本課題突破傳統的中藥劑型，將豬苓多糖制備成脂質體，為治療慢性乙型肝炎提供了新的劑型。其增加了藥物與肝細胞的親和力，有效提高了豬苓多糖在體內的吸收，從而增強治療效果。同時，本課題的研究為脂質體的進一步研究提供了理論基礎，對拓寬豬苓多糖脂質體的生產有著重要意義。

1儀器與材料

1.1實驗材料

豬苓多糖，生理鹽水，苯酚，濃硫酸，卵磷脂，膽固醇，無水乙醇，甲醇，氯仿，磷酸鹽緩沖液，微孔濾膜，葡萄糖對照品，蒸餾水。

1.2實驗儀器

紫外分光光度儀，分析天平，旋轉蒸發儀，離心機，電子顯微鏡，激光散射粒度儀。

2項目實施方案

2.1載藥脂質體的制備

采用薄膜分散法-微孔濾膜擠壓法[7～8]，在圓底燒瓶中，將卵磷脂，膽固醇與氯仿、甲醇混合，混合均勻后放置到旋轉蒸發儀上減壓蒸發[9]，除去氯仿及甲醇，形成一層薄膜。在磷酸鹽緩沖液中加入適量的豬苓多糖，并倒入圓底燒瓶中，可形成大多層脂質體，再通過微孔濾膜即得[10]。

2.2正交試驗篩選出最佳制備工藝

2.2.1單因素試驗 在試驗過程中以包封率作為評價指標，通過對比在生產過程中各單因素對制備工藝的影響，從而確定出最佳方案。

制備溫度的選擇：水浴溫度的差異在制備過程中會影響磷脂的溶解以及膜材成膜性，進而對脂質體的穩定性造成一定的影響。在保證其他藥品和試劑用量不變的條件下，將水浴溫度改變，考察包封率在不同制備溫度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的變化程度。當40℃制備溫度時，脂質體的包封率達到最大值，繼續升溫后，磷脂不穩定，包封率呈下降趨勢，所以應選擇溫度為40℃。

氯仿和甲醇比例的確定：有機相的選擇是穩定脂質體溶液制備的關鍵，比例的變化對脂質體包封率會產生影響。考察氯仿和甲醇的比例1∶3、1∶2、1∶1、2∶1對包封率的影響，其比例為2∶1時包封率32.25%最優，將氯仿與甲醇的比例設為2∶1。

卵磷脂與膽固醇質量比的確定：膽固醇對卵磷脂凝聚結構有調節作用，隨著質量比的比例變化，包封率也會隨之變化。考察包封率在磷脂與膽固醇的比例為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1時變化程度，不同的磷脂與膽固醇的比例對包封率的影響較大，在6∶1比例條件下包封率較高。

藥物與卵磷脂質量比的確定：不同的藥脂比例會影響脂質體的包封率，試驗中保持其他條件不變，來調整藥脂比例。考察不同藥脂比對1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5對包封率的影響，在1∶10比例下包封率達到最大值35.64%。

2.2.2正交試驗 考察制劑溫度、氯仿與甲醇比例、磷脂與膽固醇的比例、藥脂比對脂質體成型影響較大的因素，選用正交表L9（34）進行正交試驗（見表1）。

通過上述正交試驗可知，脂質體處方中影響因素從大到小分別是A>C>D>B，選擇的最優處方為A2、B3、C1、D3，即本實驗最終選擇制備溫度為40℃，0.2g卵磷脂，0.04g膽固醇，0.02g豬苓多糖，氯仿甲醇比例為2∶1，進行脂質體的制備（見表3）。

2.2.3驗證試驗 重新制備了三批脂質體并根據上述最佳的配比結果，進行試驗。把測得的包封率與表2試驗模型進行對照，結果基本一致，表明此工藝穩定可行。

2.3載藥脂質體包封率的測定

2.3.1空白脂質體的制備 采用薄膜分散法-微孔濾膜擠壓法，在圓底燒瓶中，將0.2g卵磷脂，0.04g膽固醇與氯仿、甲醇（比例為2∶1）混合，混合均勻后放置旋轉蒸發儀上減壓蒸發，除去氯仿及甲醇，形成一層薄膜。將磷酸鹽緩沖液中倒入圓底燒瓶中，可形成大多層脂質體，再通過微孔濾膜即得。

2.3.2 檢測波長的確定 用儀器精密吸取2ml，濃度為50mg/mL的葡萄糖對照品溶液，用水作為空白對照，采用苯酚-硫酸法，在200～800nm的波長處進行掃描。另取空白脂質體2mL，根據上述流程操作。最終選擇檢測波長為470nm，此時的波長可以使對照品溶液出現最大吸光度，并對空白脂質體無干擾性，減小誤差。

2.3.3標準曲線的繪制 將葡萄糖對照品配制成濃度0.1mg/mL的對照品溶液。加入不同體積的葡萄糖對照品溶液（0.3mL～1.2mL）于帶塞試管中，加蒸餾水至2mL。利用苯酚-濃硫酸法測定不同體積對照品溶液的吸光度，得到回歸方程為y=0.042x+0.0394，r=0.9998。結論表明：葡萄糖在4.01μg/ml～13.38μg/ml 有著良好的線性關系。

2.3.4高速離心法測定包封率 在100mL容量瓶中放入載藥脂質體1mL，定容。用空白脂質體進行空白對照試驗，分別取載藥脂質體和空白脂質體各1.5mL，采用苯酚-硫酸法，在470nm波長處進行吸光度值的測定，用標準曲線方程計算脂質體中豬苓多糖的含量。在離心管中加入脂質體混懸液2mL，離心速度10000r/min，離心20min。用吸管取上清液1mL，定容，利用苯酚-濃硫酸法測定總多糖含量，計算求得包封率〔（W總-W游_/W脂質體×100%〕為（38.37±0.02）%。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2.3.5穩定性試驗 將脂質體分別放在溫度為4℃以及室溫下（20℃），在4℃時外觀均勻，無沉淀及分層現象;在20℃下放置3個月后時出現分層現象。由上述現象可知：4℃時脂質體穩定性較好。

2.3.6精密度試驗 取對照品溶液稀釋，共配制5份同樣的稀釋液，在配制后6h內測定6次，記錄其吸光度，最終計算出其RSD值為1.6%<2%，說明其在6h內穩定性良好。

2.4脂質體粒徑及電位的檢測

將脂質體放入顯微鏡下觀察，其形態如圖所示（圖略）。利用激光散射粒度儀進行脂質體檢測。結果表明，脂質體呈正態分布，粒徑為（115.6±5）nm，Zeta電位為（-25.8±0.56）mV。

3結論

豬苓多糖是很有價值的提取成分，在對肝組織病理損傷的治療上有著顯著作用。目前，我國對豬苓多糖的研究和應用還應該增加廣度和深度，多進行開發利用，其作用可以更好的發揮。

本課題采用薄膜分散法進行豬苓多糖脂質體的制備，并對其制備工藝進行優化。以包封率作為試驗的評價指標，采用單因素法進行對比各因素對制備工藝環節的影響，正交試驗設計出最佳的制備工藝，對脂質體的制備處方進一步優化。綜上所述：制備溫度為40℃，0.2g卵磷脂，0.04g膽固醇，0.02g豬苓多糖，氯仿甲醇比例為2∶1，驗證試驗證明了工藝的穩定性和可行性。試驗最終制備出的脂質體稀釋后呈淡藍色乳光，形態為球形或類球形。包封率較好，穩定性考察良好，適合在4℃條件下存放。

本試驗的結果可為豬苓多糖的下一步研究提供參考，具有一定的研究及推廣價值。

參考文獻

[1]趙英永，崔秀明，張文斌.豬苓的化學成分與藥理作用研究進展[J].中藥材，2009（11）：1785-1787.

[2]任玉蘭，劉娟，涂紅云.豬苓多糖治療慢性乙型肝炎的研究進展[J].陜西中醫學院學報，2006（05）：67-69.

[3]曾照軍，徐曉，金東雅.乙肝疫苗聯合豬苓多糖治療慢性乙型肝炎的臨床觀察[J].職業與健康，2004（05）：117-118.

[4]張冬青，程怡.脂質體研究概況[J].中藥新藥與臨床藥理，2002，13（02）：125-128.

[5]王志龍，趙云英，李富桂.脂質體應用的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫，2011（05）：26-28 .

[6]吳黎文，聶玲.中藥脂質體靶向給藥的研究進展[J].中國藥物經濟學，2012（02）：352-354.

[7]張祺照.脂質體制備方法研究概況[J].亞太傳統醫藥，2013（12）：71-72.

[8]侯麗芬，谷克仁，吳永輝.不同制劑脂質體制備方法的研究進展[J].河南工業大學學報（自然科學版），2016（05）：118-

124.

[9]曾丹，張陽德，趙東偉.脂質體制備中超聲參數的研究[J].中國現代醫學雜志，2012（19）：25-28.

[10]賈少杰，陳文強，解修超.秦巴山區豬苓多糖的提取及其脂質體生產工藝的優化[J].安徽農業大學學報，2018（04）：715-

722.

作者簡介：韓悅，在讀本科生，研究方向：藥物遞送系統的研究

通訊作者：李早慧，碩士，講師，研究方向：中藥現代給藥系統和中藥新藥的研究。