肺癌患者血清miRNA-22表達水平及臨床意義探討

楊俠 張秋紅 蘇文媚 張明 單虎 張潔 陳國安 郭春芳 李雅莉

1西安交通大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科710004;2廣東醫科大學附屬醫院腫瘤科,湛江524000;3南方科技大學醫學院,深圳518000;4美國密西根大學胸外科,安娜堡48109

肺癌是目前世界范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之首[1]。肺癌的臨床分型包括非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)。二者不僅在臨床占比上明顯不同(NSCLC：80%～85%;SCLC：15%～20%),而且在惡性程度、病情進展、臨床治療和預后等方面也迥然相異[2]。近年來,隨著抗腫瘤靶向藥物及免疫治療的應用,肺癌患者的整體生存期顯著提高,但目前約75%的肺癌患者在就診時已屬中晚期,整體5年生存率仍僅為15%左右,缺乏有效的早期診斷是主要原因之一[3]。美國癌癥學會發布的最新數據顯示,經過規范治療后,原位癌患者治愈的可能性近100%,而隨著病情的進展,Ⅰ～Ⅳ期肺癌患者的5年生存率從88%驟降為2%～15%[4-5]。因此,提高肺癌的早期診斷率已成為世界范圍內的共識。肺癌起病隱匿,早期常因缺乏典型癥狀而錯過最佳診治時間。一直以來,胸部X 線片、痰涂片和癌胚抗原檢查是篩查吸煙等肺癌高危人群的主要方式,但收效甚微。2011年美國國家肺癌篩查研究小組等[6]在《新英格蘭醫學雜志》上發表了一篇具有開創意義的報道,顯示在肺癌高危人群中使用低劑量CT(low-dose CT,LDCT)進行肺癌篩查比胸部X 線片篩查相對死亡率降低20%。自此,LDCT 成為早期肺癌篩查的重要手段之一,但近些年的研究數據表明,LDCT 篩查試驗存在漏診和過度診斷之嫌,費用也高居不下,因此,開發新的實用且性價比高的肺癌診斷方法已成為當務之急[7]。

miRNAs是一類長度為20～22個核苷酸的非編碼RNA 分子,于1993年首次在新秀麗線蟲內發現[8]。miRNAs通過其3'端的UTR 區與目的基因的m RNA 相互作用,在轉錄后水平選擇性降解m RNA 或抑制基因翻譯進而實現調節目的基因的表達。近年來大量的研究表明,miRNAs表達失調與包括肺癌在內的許多人類癌癥的發生、發展密切相關。miRNAs不僅在進化上具有高度的保守性、時序性、組織和細胞特異性,而且存在于循環體液中(組織液、痰液、血液等)的miRNA(循環miRNA),對嚴苛的體內外環境(高溫、高p H值、反復凍融等)和對抗RNA 酶消化等方面表現出極強的耐受性和穩定性,因此,上述這些優點使循環miRNAs 有望成為腫瘤診斷的潛在標記物[9-11]。尤其在目前肺癌的早期篩查診斷缺乏行之有效的手段下,探索發現新的潛在的肺癌miRNA分子標記物已成為國內外廣大科研工作者的研究方向。

本課題組前期與美國密西根大學胸外科合作,在對54例肺癌患者和47例健康對照人群的血清樣本進行胸外科分析發現,miR-22在肺癌患者的血清中表達明顯升高。為了進一步驗證這一結果的可靠性,我們又重新募集了另一組獨立且擴大的血清樣本,采用熒光定量PCR 分析,對肺癌患者和非肺癌患者外周血中miR-22 水平進行比較,探討miR-22在肺癌患者中的表達及其診斷價值。

1 對象與方法

1.1研究對象及標本來源 募集2011～2017年密西根大學醫學院收治并確診的126例肺癌患者作為肺癌組,其中NSCLC 116 例(腺癌77 例、鱗癌22例、大細胞癌17例)和SCLC 10例;Ⅰ期68例,Ⅱ期25 例,Ⅲ期17 例,Ⅳ期7 例。此外,152例非肺癌對照組選自密西根大學醫學院同期性別、年齡相近的非肺癌患者103 例(肺良性結節26例、COPD29例、系統性紅斑狼瘡48例)及健康人群49例。肺癌組和非肺癌對照組性別、年齡及吸煙狀況匹配。本研究通過美國密西根大學健康倫理委員會審查批準(00004969),且所有研究對象均簽署知情同意書后,肺癌組患者收集3～5 ml治療前(包括術前)血液樣本,非肺癌對照組均門診采集相應的血液樣本,于采血后1 h內將所有血液樣本經1 000×g,4℃離心15 min后,分離血清,每個試管300μl分裝保存于-80℃冰箱內待用。

1.2血清總miRNA 提取和miR-22的檢測

1.2.1總miRNA 的提取 200μl血清總miRNA經miRNA 提取試劑盒(miRNeasy Serum/Plasma Kit,美國Qiagen 公司)提取,經分光光度計(Nanodrop 2000 spectrophotometer,美國Thermo Scientific公司)檢測提取RNA 的濃度和純度,當A260/280比值為1.9～2.1時認為提取的RNA 純度合格。

1.2.2miR-22表達檢測 100 ng總RNA 經反轉錄試劑盒(miScript ⅡRT Kit,美國Qiagen 公司)產生cDNA。熒光定量PCR 反應檢測miR-22表達水平(miScript SYBR?Green PCR Kit,美國Qiagen公司)。反應條件為：95℃預變性15min,94℃變性15 s,55℃退火和70℃延伸多30 s,共40個循環。miR-22 引物購自美國Invitrogen 公司。采用Cel-miR-39作為外參,miR-22相對表達量以log(2-ΔΔCt)表示。

1.3統計學分析 采用GraphPad Prism 6、Excel和R 軟件對數據進行分析。所有數值均以±s表示。試驗資料中的計量資料均做正態性檢驗,其中符合正態分布的資料,多組間的比較采用單因素方差分析、LSD 和HSD 法;不符合正態分布的資料則采用Mann-Whitney 秧和檢驗比較兩組間各指標。受試者工作特征曲線及其曲線下面積(area under curve,AUC)評價miR-22在肺癌及其各亞型或各臨床分期的患者與非肺癌對照組人群的診斷價值。約登指數用于選取臨界診斷閾值以及其對應的敏感度和特異度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1血清miR-22在肺癌組和非肺癌對照組中的表達 血清miR-22 在NSCLC 患者、SCLC 患者和非肺癌對照組中的相對表達量分別為1.63±1.43、1.10±1.64和-0.02±1.31,NSCLC 患者miR-22表達高于SCLC患者及非肺癌對照組(F=49.35,P＜0.01),SCLC 患者與非肺癌對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05),見圖1。

圖1 非小細胞肺癌患者、小細胞肺癌患者和非肺癌對照組中血清miR-22的表達

2.2miR-22 在NSCLC 患者各臨床分期中的表達 NSCLC患者Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期血清miR-22的相對表達量分別為1.65±1.36、1.49±1.60和1.0±1.42,與非肺癌對照組比較均升高(P值均＜0.05),各期肺癌之間比較差異均無統計學意義(P值均＞0.05),見圖2。

圖2 非小細胞肺癌各臨床分期與非肺癌對照組血清miR-22的表達比較

2.3miR-22 的表達與NSCLC 病理型之間的關系 NSCLC患者不同病理亞型(腺癌、鱗癌和大細胞癌)之間miR-22相對表達量比較,差異均無統計學意義(P值均＞0.05)。非肺癌對照組中肺良性結節、COPD、系統性紅斑狼瘡和健康人群之間進行比較,差異均無統計學意義(P值均＞0.05),見圖3。

圖3 肺癌各病理類型以及非肺癌對照組各亞群之間血清miR-22表達比較

2.4NSCLC患者血清miR-22 受試者工作特征曲線分析 miR-22在NSCLC 患者中的AUC 為0.80(95%CI：0.75～0.85,P＜0.001),當設定最佳臨界值后,miR-22 診斷NSCLC 的敏感度和特異度分別為73.03%和70.69%。miR-22 在NSCLC患者各病理亞型以及各臨床分期中的AUC為0.72～0.82。當分別取最佳臨界值時,敏感度為70.59%～75.32%,特異度為54.61%～73.03%(圖4、圖5、表1)。

表1 非小細胞肺癌患者工作特征曲線分析及敏感度和特異度

3 討論

近年來,包括靶向藥物廣泛應用在內的肺癌治療水平呈現出極大的進步,但迄今為止,肺癌依舊是我國乃至全球范圍內的發病率和病死率最高的惡性腫瘤。究其原因,缺乏有效的早期診斷方法是其重要桎梏之一,因此提高肺癌的早診率成為當今亟待解決的重大課題。miRNAs是一類長度為20～22個核苷酸的非編碼RNA 分子,隨著miRNA 與腫瘤相關性的報道不斷擴大和深入,尤其是穩定存在組織或血液(血清、血漿和血細胞)里的miRNA,成為極具前途的腫瘤標記物[12-14]。

圖4 受試者工作特征曲線分析miR-22在及其各病理類型中的診斷意義

圖5 受試者工作特征曲線分析miR-22在非小細胞肺癌各臨床分期中的診斷意義

我國李璽等[15]收集NSCLC 患者32例,獲取EBUS-TBNA 標本,采用實時定量PCR 方法檢測miRNA-21、miRNA-126、miRNA-155、miRNA-200c、miRNA-205和miRNA-375的表達水平,證實6 種 miRNA 對 NSCLC的診斷有價值,miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205可能還具有鑒別肺鱗腺癌的作用。意大利學者報告了兩項關于血清/血漿miRNA 檢測用于肺癌篩查的大規模驗證性研究[16-17]。Sozzi等[17]以870例健康者和69例肺癌患者為研究對象,通過檢測吸煙者血漿24種miRNA 來診斷肺癌,發現敏感度達到87%,特異度達到81%。miRNA 檢測和LDCT 聯合應用可使LDCT 假陽性率降低5倍,達到3.7%。另一項研究在肺癌高危人群(1 067例無癌個體和122例癌癥患者)中聯合檢測13種miRNA,結果提示準確率、敏感度和特異度分別為74.9%、77.8%和74.8%,AUC為0.85[16]。Moretti等[18]對20項研究的系統回顧表明,用于肺癌檢測的各種miRNA的AUC 范圍為0.62～0.94。這些研究證實了miRNA 作為循環腫瘤標記物在肺癌診斷、預后或監測方面的潛在價值。

miR-22位于17p13 染色體,在進化上相對保守。大量研究表明,miR-22不僅在生物學上影響衰老、血管生成、上皮間質細胞轉化以及細胞增殖、侵襲、轉移和凋亡等過程,而且,miR-22 通過其表達上調或下調參與不同癌癥的發生、發展,如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌,并在不同遺傳背景下發揮促癌或者抑癌的雙重作用[19-21]。此外,研究還表明,循環miR-22的異常表達在癌癥早期即可出現,有些還隨著癌癥進展而波動,呈現出時間的差異性,這些特征使miR-22具有作為潛在腫瘤標記物的特征,對腫瘤的早期診斷、治療、療效和預后的評估產生深遠的影響。

本研究首先進行了肺癌組和非肺癌對照組血清miR-22相對表達量之間的比較。結果顯示,血清miR-22在肺癌患者尤其NSCLC 患者中的相對表達量明顯高于非肺癌對照組。Ⅰ期肺癌患者血清miR-22水平明顯高于非肺癌對照組,提示miR-22在早期肺癌患者中的表達即明顯升高,為miR-22作為潛在的肺癌早期診斷標記物提供了實驗基礎。本研究還發現miR-22的表達只與占肺癌總數絕對優勢的NSCLC相關,NSCLL各病理亞型(腺癌、鱗癌和大細胞癌)之間miR-22相對表達量比較差異均無統計學意義。此外,非肺癌對照組各亞組(系統性紅斑狼瘡、肺良性結節、COPD與健康人群)之間miR-22相對表達量比較,差異無統計學意義,該結果進一步支持miR-22不受多種良性疾病的干擾,提高了其作為NSCLC 診斷標記物的特異性。研究進而以全部非肺癌對照組作為陰性對照,通過分析NSCLC 患者AUC,評估血清miR-22在NSCLC 診斷中的價值。結果提示NSCLC患者及其各病理類型、各臨床分期的AUC數值在0.72～0.82之間,證實血清miR-22具有較好的肺癌診斷應用價值。

綜上所述,血清miR-22水平對肺癌早期診斷具有重要意義,作為非侵襲性的檢測手段,miR-22有望成為肺癌輔助診斷的新指標。本課題組將進一步檢測肺癌患者治療(包括手術、靶向治療、化療、免疫治療)前后血清miR-22水平的變化,進一步探索miR-22在肺癌發生、發展中的重要作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突