雙氫青蒿素聯(lián)合順鉑活化Caspase-6、Lamin A/C表達(dá)誘導(dǎo)H1299細(xì)胞凋亡

田祺 高立明 尹小波 徐淑鳳 趙靖 劉菲菲 羅坤 石珊珊

秦皇島市第一醫(yī)院呼吸一科066000

肺癌的發(fā)病率在全世界范圍都在逐漸升高,它也是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1-2]。近年來針對肺腺癌的治療手段日益增多,但迄今為止,含鉑化療仍是肺腺癌患者最重要的治療手段之一。因此,尋找能提高化療有效率的新藥物是很值得期待及研究的。

雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是一種青蒿素的衍生物,已被證明具有強(qiáng)力的抗癌活性,能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡且無明顯不良反應(yīng),因此應(yīng)用于臨床已有多年[3-4]。近年研究表明,青蒿素、青蒿琥酯和DHA 在一些化療出現(xiàn)多重耐藥的腫瘤細(xì)胞株中均已經(jīng)展現(xiàn)出強(qiáng)力的抗癌活性[5]。據(jù)報道,DHA 能增強(qiáng)人類卵巢癌細(xì)胞對卡鉑的敏感性[3]。DHA 通過含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)相關(guān)的凋亡通路,能夠增強(qiáng)白蘚堿誘導(dǎo)侵襲性肺腺癌A549 細(xì)胞的凋亡[6]。DHA 對胰腺癌、白血病、骨肉瘤及肺癌細(xì)胞均展現(xiàn)出顯著的抗癌活性[7]。本研究旨在探討DHA 聯(lián)合順鉑(cisplatinum,Cis)對H1299 肺腺癌細(xì)胞增殖的影響及Caspase家族相關(guān)下游凋亡蛋白Caspase-6、Lamin A/C的表達(dá)情況。

1 材料及方法

1.1材料 人肺腺癌H1299細(xì)胞由解放軍總醫(yī)院王平老師惠贈。細(xì)胞在含10%胎牛血清及青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)箱的條件是5%CO2、37℃。

1.2藥品與試劑 DHA 購自重慶華立藥業(yè)股份有限公司,溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配成濃度為100 mmol/L 的存儲液;Cis購自齊魯藥業(yè)有限公司。青鏈霉素、DMSO、赫斯特(Hoechst)33258、Annexin-V 和碘化丙啶購自美國Sigma公司。RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco 公司。Caspase-6、Lamin A/C一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國CST公司。

1.3試驗方法及指標(biāo) 本研究將人肺腺癌H1299細(xì)胞按處理藥物不同分為4組,分別為：雙氫青蒿素組;順鉑組;雙氫青蒿素+順鉑組;對照組。

1.3.1腫瘤細(xì)胞抑制率 采用MTT 試驗評價DHA 與Cis單用及聯(lián)用對H1299 細(xì)胞增殖的影響。將H1299細(xì)胞稀釋成密度為3×104個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液,按每孔100μl鋪96 孔板并孵育過夜。將倍比稀釋的DHA 及Cis分別或聯(lián)合加入培養(yǎng)基(DHA 的濃度分別為：2.5、5、10、20、40和80 μmol/L;Cis的濃度分別為1.56、3.12、6.25、12.5、25 和50μmol/L)。將96 孔板置于二氧化碳孵箱中分別孵育24 h 和48 h 后加入MTT 工作液(5 g/L)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清,加入DMSO 震蕩溶解甲瓚結(jié)晶。用酶標(biāo)儀在490 nm 波長下檢測吸光度(optical density,OD)值,計算藥物處理后對細(xì)胞生長的抑制率=1-(實驗組OD 值/對照組OD 值)×100%,使用Calcusyn軟件來計算藥物的半數(shù)抑制濃度(50%inhibition concentration,IC50)并評價聯(lián)合用藥的抗增殖作用。

本研究采用中效原理(Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法)觀察聯(lián)合指數(shù)的評價[8]。聯(lián)合指數(shù)的計算方程式為：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+[(Dx)1/(Dx)2]/[(D)1+(D)2]。分子的(D)1、(D)2分別代表聯(lián)合抑制x%時藥物1和藥物2的濃度。分母的(Dx)1、(Dx)2分別代表單藥抑制x%時藥物1和藥物2的濃度。CI值＜1、=1 和＞1分別代表協(xié)同作用、累加作用和拮抗作用。2種藥物聯(lián)合應(yīng)用抗惡性腫瘤細(xì)胞的CI值計算通過Calcusyn軟件完成。

1.3.233258 染色 根據(jù)Hoechst 33258 試劑說明對各組細(xì)胞核進(jìn)行染色,染色結(jié)束后用倒置熒光顯微鏡觀察及拍照。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù) 將H1299細(xì)胞按3×105/孔,鋪6孔板孵育過夜,按不同組別加入處理藥物孵育48 h。收集細(xì)胞并用PBS 清洗細(xì)胞離心后加入100μl Annexin V結(jié)合緩沖液、5 μl Annexin VFITC和10μl碘化丙啶。孵育細(xì)胞15 min后再次加入結(jié)合緩沖液400μl并吹散細(xì)胞,最后用流式細(xì)胞儀分析染色后的細(xì)胞分布情況。

1.3.4蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 采用Western blot分析從不同處理組的細(xì)胞中提取的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。按不同分組分別處理細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞,PBS清洗離心后在冰上加入RIPA 裂解液震蕩裂解30 min。離心并吸取含總蛋白的上清,煮沸變性后加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液備用。采用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量,獲得不同樣本上樣劑量。等量待測蛋白及蛋白標(biāo)記物分別加入各孔中,在10% 濃縮膠中80 V 電壓下電泳20 min,12%分離膠中120 V 電壓下電泳50 min。然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉。TBST 洗膜后用按說明稀釋后的一抗4℃冰箱孵育過夜,再次用TBST 洗膜后用稀釋完成的二抗室溫下孵育1 h。目標(biāo)蛋白條帶位置加上發(fā)光液后在暗室中使用膠片曝光、洗片,膠片掃描入電腦進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。數(shù)據(jù)以±s表示。百分比數(shù)值采用Kruskal-WallisH非參數(shù)檢驗進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DHA 聯(lián)合Cis組對H1299細(xì)胞的增殖抑制率高于單藥組 將不同濃度的DHA、Cis及DHA+Cis加入H1299培養(yǎng)基中。結(jié)果表明聯(lián)合用藥組對H1299細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于單藥組(P＜0.01),單藥組對細(xì)胞的抑制率高于對照組(P＜0.01),見圖1。

圖1 MTT 試驗各組細(xì)胞抑制率

2.2DHA 聯(lián)合Cis產(chǎn)生協(xié)同抑制H1299細(xì)胞的作用 通過MTT 試驗計算不同濃度DHA(2.5～80μmol/L)、Cis(1.56～50μmol/L)及聯(lián)合用藥處理48 h后對H1299細(xì)胞增殖的影響,重復(fù)3次。通過中效原理使用Calcusyn軟件計算2種藥物的聯(lián)合指數(shù)(CI值)均小于1.0,表示聯(lián)合用藥具有明顯的協(xié)同作用(表1)。

表1 DHA 聯(lián)合Cis作用于H1299細(xì)胞不同濃度配比的聯(lián)合指數(shù)

2.3DHA 聯(lián)合Cis對H1299細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡作用 對不同處理組的H1299 細(xì)胞進(jìn)行Hoechst 33258染色,通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化。DHA 聯(lián)合Cis作用于H1299細(xì)胞后細(xì)胞核呈現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)-染色質(zhì)聚集、核皺縮以及核碎裂。另外,通過流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理組間H1299細(xì)胞的凋亡情況(圖2)。在細(xì)胞早期凋亡階段,凋亡細(xì)胞的磷脂酰絲氨酸外翻并可與染色劑Annexin-V 結(jié)合。而在凋亡后期,由于細(xì)胞膜完整性的破壞,核染色劑碘化丙啶能穿透細(xì)胞膜將細(xì)胞核染色。結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞百分率分別為9.09%(對照組)、17.07%(DHA 20μmol/L 處理24 h)、17.29%(Cis 12.5μmol/L處理24 h)、25.09%(DHA 20μmol/L+Cis 12.5μmol/L 處理24 h),見圖3。

圖2 赫斯特33258染色試驗各組細(xì)胞核形態(tài) SP ×400 A：對照組;B：雙氫青蒿素20μmol/L 處理24 h;C：雙氫青蒿素20μmol/L+順鉑12.5μmol/L處理24 h

2.4Western blot檢測各處理組Caspase家族凋亡靶蛋白Caspase-6、Lamin A/C 的表達(dá)情況 通過目標(biāo)蛋白條帶可以看出聯(lián)合用藥組Caspase-6及Lamin A/C的活性片段的表達(dá)均高于單藥組,單藥組高于對照組(圖4)。

3 討論

近些年,傳統(tǒng)中藥提取物在腫瘤治療中的研究日益受到重視[9]。DHA 是一種青蒿素的衍生物,近些年它的抗癌活性正在被全世界廣泛研究。研究表明DHA 可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,通過Fe2+介導(dǎo)的直接殺傷作用,抑制腫瘤血管生成等機(jī)制達(dá)到抗腫瘤作用[10]。因此本研究選擇了DHA及Cis作用于人類非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞株單藥及聯(lián)合用藥抗腫瘤的效果并對Caspase-6 和Lamin A/C表達(dá)進(jìn)行分析。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組凋亡細(xì)胞百分比 A：對照組;B：雙氫青蒿素組;C：順鉑組;D：雙氫青蒿素+順鉑組

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 A：Lamin A/C 的活性片段Cleaved Lamin A/C 的表達(dá);B：Caspase-6的活性片段Cleaved-Caspase-6的表達(dá)

據(jù)報道,DHA 與許多其他的抗癌藥物聯(lián)用都有較好的協(xié)同作用[6,11-12],本研究結(jié)果顯示：DHA聯(lián)合Cis組對H1299細(xì)胞的抑制率明顯高于單藥組。另外,本研究通過DHA 與Cis不同濃度配比下作用于H1299細(xì)胞48 h后的細(xì)胞抑制率,計算了兩藥聯(lián)合的CI值,其結(jié)果均小于1.0。進(jìn)一步證明了DHA 聯(lián)合Cis抑制人類肺腺癌H1299細(xì)胞增殖具有明顯的協(xié)同作用。

細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而引發(fā)的細(xì)胞的主動死亡[13],其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)主要包括染色質(zhì)的凝聚、邊集以及細(xì)胞核皺縮、碎裂等。本研究中Hoechst 33258細(xì)胞核染色的結(jié)果顯示雙氫青蒿素聯(lián)合順鉑可以引起肺腺癌H1299細(xì)胞凋亡。

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族的多個成員,參與細(xì)胞的增值、遷移及細(xì)胞免疫,同時參與調(diào)解細(xì)胞的凋亡[14]。Caspase-6已經(jīng)被證實在執(zhí)行細(xì)胞凋亡的過程中有很大的貢獻(xiàn)[15]。Caspase-6平時以無活性的形式存在,當(dāng)?shù)蛲鲂盘柎碳に?裂解為具有促凋亡活性的Cleaved-Caspase-6,從而使細(xì)胞凋亡[16]。

Lamin A/C是維持細(xì)胞核形態(tài)的關(guān)鍵蛋白[17]。并參與DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。當(dāng)?shù)蛲鰡訒r,Lamin A/C可作為Caspase-6活化片段的特異性底物被裂解為2 個相對分子質(zhì)量分別為47 000和37 000的活性片段[18-19]。二者的活性片段能使細(xì)胞核功能失調(diào)并共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)DHA 聯(lián)合Cis 組與單藥組相比能顯著提高Caspase-6及Lamin A/C活性片段的表達(dá),具有更強(qiáng)的促凋亡作用,這與早前的研究結(jié)果相符。

本研究表明DHA 聯(lián)合Cis能誘導(dǎo)人類肺腺癌H1299細(xì)胞的凋亡并具有協(xié)同作用。DHA 能增強(qiáng)Cis對H1299的抗癌活性,這與之前的報道結(jié)果類似[21]。Caspase家族下游凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-6及Lamin A/C 活性片段的高表達(dá),揭示了其與DHA 聯(lián)合Cis引起H1299細(xì)胞凋亡存在關(guān)聯(lián),可能與激活了Caspase家族相關(guān)的凋亡通路,引起腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖有關(guān)。這為進(jìn)一步研究DHA 聯(lián)合Cis用于人類非小細(xì)胞肺癌的治療提供了有用的信息和理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突