CRISPR/Cas9技術的發展與應用

李沛哲

摘要：CRISPR/Cas9是一種用于靶向特定基因的DNA修飾工具，產生于細菌和古細菌，是一種適應性免疫系統，就像文字糾錯軟件，可以檢測到病毒DNA并將其消滅并修復。經過不斷發展，已有多個物種應用這一系統用于研究，還可能將應用于基因編輯的科研、臨床治療等，現已證明CRISPR/Cas9技術擁有一定優勢，比如設計簡單，操作容易，但是背后還存在道德倫理問題，以及該技術本身存在的問題如脫靶效應。

關鍵詞：CRISPR/Cas9基因編輯疾病治療免疫防御

1.研究背景

20世紀70年代DNA重組技術開始發展，這標志著生物學進入了一個新階段。分子生物學家第一次獲得了操縱DNA分子的能力，使研究基因和利用它們開發新的藥物和生物技術成為可能。

廣義來說，基因組工程指的是對基因組進行有針對性的修改、其上下片段（如表觀遺傳標記）或其輸出（如轉錄本）的過程。在真核生物中，特別是在哺乳動物細胞中能夠十分容易且有效地做到這一點，對改變基礎科學、生物技術和醫學有著巨大的作用

生物的遺傳信息儲存在基因中，蛋白質是由編碼基因決定的。基因突變時，其編碼的蛋白質的氨基酸組成也會改變，有些蛋白質會提前終止翻譯，遺傳疾病就會發生。特異性的修飾基因組靶點，可以用來治療遺傳病，人們研究修飾位點時，在細菌和古細菌中找到了某種 RNA，它可以用來標記位點，命名為gRNA。CRISPR/Cas9蛋白和gRNA彼此之間相互作用，使得切割都發生在正確的位置。

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一種用于靶向基因特定DNA修飾的工具，細菌在其成長環境中需要不斷對抗病毒，CRISPR指的是一種適應性免疫系統，其產生于細菌和古細菌，它們為了應對病毒的攻擊而逐漸進化，產生了這種系統，在CRISPR作用之下，可以檢測到病毒的DNA并將其消滅，該機制中，Cas9是一種蛋白質，作用是尋找并切斷病毒的DNA，使其降解，crRNA（CRISPR-derived RNA）與tracrRNA（trans-activating RNA）會結合形成一種復合物，該復合物能特異性識別靶基因序列，引導Cas9核酸內切酶在定位點將雙鏈DNA剪斷，然后，其非同源末端與修復機制相連接，將重新連上斷裂處的基因組DNA，精準插入特定的DNA片段，這就是說，假如能夠造成雙鏈斷裂，則可以誘發細胞進行修復，方式為干預或融入新基因，另外還有一種修飾DNA的方法即將外源DNA的一個片段整合進斷裂處。

基于CRISPR-associated RNA引導的核酸內切酶Cas9的基因組工程技術的最新進展，讓我們有機會對哺乳動物基因組系統功能進行探究。就像文字糾錯軟件，Cas9可以通過短的RNA字符引導到復雜基因組中的特定位置并修改錯誤。這一系統使得內源性基因組內的DNA序列及其功能輸出可以所有有機體中輕松調控或編輯。這篇綜述描述了CRISPR/Cas9技術的發展與應用，同時強調了存在的問題以及未來的展望。

2.CRISPR的發展歷程

CRISPR的研究開始于1987年，Nakata和同事在研究大腸桿菌中參與堿性磷酸酶同工酶轉化的iap酶時，報告了iap基因下游29個nt重復序列并不像大多數重復的元素，采取串聯重復的形式，這29個nt重復被5個中間的32個nt非重復序列間隔。在接下來的10年里，隨著更多的微生物基因組被測序，從不同細菌的基因組中報告了更多的重復元素。Mojica和他的同事最終將間隔重復序列作為一個獨特的重復元素家族進行了分類。2007年，研究表明，以增添或消除與噬菌體DNA相匹配的間隔區DNA這一方式，可以達到改變嗜熱鏈球菌對噬菌體的抵抗力的目的。2011年科學家著手研究與CRISPR相關的蛋白質的各種功能，并且成功分離出了Cas9蛋白質的CRISPR系統，這項研究解釋了間隔區 DNA是如何在細菌免疫防御中發揮作用的。2013年，兩項研究同時展示了如何從嗜熱鏈球菌和膿鏈球菌中成功構建II型CRISPR系統，達到哺乳動物細胞的基因組編輯目的。成熟crRNA-tracrRNA雜交體的異體表達，還有sgRNAs指導哺乳動物細胞基因組中的Cas9裂解，會刺激NHEJ基因組編輯。多個引導RNA也可以同時用于定位多個基因。自此，Cas9已被數千家實驗室用于各種實驗模型系統的基因組編輯應用。Cas9技術的迅速應用也通過開源分銷商和一些在線用戶論壇而大大加快。

從發現到2013年系統的建立，CRISPR在多種物種中已經得到應用，并且用于應用的物種的數目還會繼續增加。

3.CRISPR的工作原理

盡管科學家到現在為止還沒有徹底發掘CRISPR/Cas9系統的具體的作用機制，但該系統的作用過程已基本清楚，即大致分為以下3個階段。

（1）當病毒感染細胞時，病毒攜DNA進入細胞，在一個細菌體內，CRISPR會將病毒內的 DNA抽出，然后以碎片的形式插入細菌 DNA中，其基因組裂解。

（2）Cas9與RNA的復合體切斷基因組中的雙鏈間隔序列，再整合至宿主基因組，其中較短的參入間隔序列轉錄，因而crRNAs產生。

（3）細胞有能力尋找斷鏈的DNA，并對其進行修復，是在Cas蛋白復合物的參與下，靶向干擾噬菌體的基因組序列。

4.CRISPR/Cas9技術在疾病研究中的應用

4.1疾病模型的構建

現如今，大多數遺傳病的研究是通過對患者的iPS細胞的研究來實現的，這會耗費大量時間，同時也受到細胞是否可以得到和遺傳背景多樣性的限制。現在研究者已經發現了新的可以模擬阿爾茲海默癥的疾病表現的方法，正是利用CRISPR/Cas9技術，可以將一種阿爾茲海默癥的遺傳突變引入，在引入突變的位置和切割的位點之間，他們發現存在一段序列距離，而干細胞基因組的編輯就可以用到這種距離關系，因此，研究人員將干細胞基因組加以編輯，疾病基因就成功包含在干細胞中，再利用誘導技術，干細胞轉化為神經元細胞，這就起到了模擬疾病的作用。

4.2疾病的治療

目前，病毒治療的方法尚且缺乏，但是 CRISPR/Cas9系統給治療病毒提供了新的方法，當DNA中出現了一個雙鏈斷裂時，就可以引入修復機制，其效果也十分顯著，比如糾正鐮狀細胞貧血突變基因，另外研究表明HIV病毒可以利用CRISPR/Cas9技術從體外培養的人體T細胞中有效清除。遺傳病防治中，血友病B非常適合基因治療和基因編輯技術，GuanY等人發現人的F9基因上的突變Y371D引起的血友病比突變Y371S更加嚴重，通過靶向這一基因位點的CRISPR/Cas9系統，他們對小鼠加以治療，結果顯示，當以腺病毒為載體時，基因編輯系統的糾正率較高，但是因為肝毒性十分嚴重，因此還要進一步改進。

人們還在研究如何利用CRISPR/Cas9技術治療癌癥，經過研究發現，敲除相關基因會是一個十分有效的方法。在2015年，正是利用了CRISPR技術，人類關于癌癥的治療有了重大突破：利用一種慢病毒載體，研究者發現 CRISPR系統會被doxycycline誘導表達，細胞的編輯也十分高效，而最關鍵的是癌基因 MCL-1被成功敲除，且包括體內和體外兩種環境都得以實現。自此，腫瘤治療迎來了新的機遇，利用敲除癌基因這一技術，人們有機會在未來將其用于臨床治療。

5.Cas9的應用優勢

首先，CRISPR/Cas9技術的一大應用就是可以用來對菌種進行分類，得益于其重要特性，分類效果顯著提高;第二，CRISPR/Cas9系統會構成特異性的單鏈切口，這與遺傳學中常常使用的人工核酸酶（ZFN或TALEN）有所不同，細胞的同源重組會被其有效激活，這就展現了與原有技術相比更有利的一面。第三，對CRISPR/Cas9進行多個位點修飾途徑，達成較長片段缺失的突變改造機制，這給長期困擾人們的遺傳病的治療提供了新思路。

如果能充分利用CRISPR/Cas9系統及其相關的基因編輯技術，很有可能使人們漸漸接受轉基因這一至今仍備受爭議的技術，轉基因的動植物，比如一些重要的家畜，我們可以利用CRISPR/Cas9技術修飾它們的基因組，使其表現出更優良的性狀，現在，研究人員已經可以利用這一技術改良和提高綿羊的肌肉含量，還有家豬的瘦肉率等等。

6.存在的問題

基因編輯引發了不少道德倫理方面的問題，這是因為這項技術不僅可以應用于成人細胞上，還可以用在一些生物體的胚胎身上，包括我們人類本身。另外，脫靶現象也是科學家正在研究和盡力控制的一個問題。

何為脫靶？最開始，人們普遍認為 CRISPR/Cas9若想要切割一段DNA序列，就必須與DNA所攜帶的速查表能夠完全匹配，不過現如今已經證實這一想法并不是正確的。與靶DNA相近的DNA序列有時也會被切割，但是這些序列卻含有與靶DNA不相同的堿基，且數目較大。研究者發現CRISPR/Cas9這一脫靶現象會對細菌產生有利影響，使它們能夠免受病毒攻擊，因為CRISPR/Cas9系統可以跟蹤不斷變異的病毒的進化過程，但是對人類是無益的，一旦脫靶，人類的遺傳物質就會被破壞，這將造成十分嚴重的影響。

7.展望

CRISPR/Cas9是一種較為安全的“剪刀”，會給臨床治療提供一個嶄新的思路，隨著 CRISPR/Cas9系統的發展和普及，不僅可以用于科研的基因編輯領域，還可以用來治療疾病，減少食品安全問題等等，在接下來的10年中，我們將看到這項技術在臨床上的應用，尤其是適用于成年人身上的應用，我們會看到很多臨床試驗，甚至還有可能被批準用于治療，正是因為這項技術的優越性，很多新公司打算要將它商業化，也會有很多的投資者表現出對這些公司的興趣，但不得不考慮的是這項技術還應該可以深度優化，尤其是當我們知道了關于人類的一些基因信息，CRISPR就提供了一種工具，這就會引起一系列道德倫理問題，需要我們認真對待。我們所有人都有責任去考慮這項技術背后的預期和非預期后果。

（作者單位：四川農業大學）