哈維氏弧菌PspF基因的克隆及原核表達分析

馬少鴻，黃郁蔥，簡紀常，蔡雙虎

哈維氏弧菌基因的克隆及原核表達分析

馬少鴻，黃郁蔥，簡紀常，蔡雙虎

（廣東海洋大學水產學院 // 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【】對哈維氏弧菌（）ZJ0603的基因進行克隆與原核表達分析，優化表達條件?？寺」S氏弧菌菌株ZJ0603的基因，對其編碼蛋白進行理化性質、信號肽、亞細胞定位、二級結構及三級結構分析，構建表達載體pET28a-，經HI和I雙酶切和測序鑒定正確后轉入表達菌株大腸桿菌BL21，對表達重組菌株進行表達條件優化及Western Blot鑒定。基因的開放閱讀框（ORF）全長為1 179 bp，編碼336個氨基酸，分子質量為38.04 ku，理論等電點5.27，不穩定系數41.97，總平均親水性-0.382，PspF蛋白整體表現為親水性蛋白。成功構建含pET28a-的表達菌株，其最佳誘導條件為37 ℃下異丙基---硫代半乳糖苷（IPTG） 0.2 mmol/L誘導6 h，其表達蛋白為38 ku。Western Blot結果表明PspF重組蛋白成功獲得，蛋白同源性高，具有作為抗弧菌病疫苗的潛力。

哈維氏弧菌；基因；原核表達；表達優化

哈維氏弧菌（）是一種主要分布于海洋的革蘭陰性菌，兼性厭氧，嗜鹽，是多種海水動物的常見致病菌[1]，其在適宜溫度下可快速生長繁殖為優勢菌種，通過口、鰓及體表等途徑侵染養殖動物[2]，致使養殖動物大批量死亡，在大西洋棘白鯧（）[3]、對蝦（）[4]、石斑魚（sp）[5]、大黃魚（）[6]和線紋海馬（）[7]等多種養殖經濟動物都爆發過大規?；【?，嚴重危害海水養殖業的發展。

PspF蛋白為噬菌體休克蛋白（Phage shock protein）操縱子轉錄激活因子，其能激活噬菌體休克蛋白系統表達[8]。噬菌體休克蛋白系統是一種應激反應途徑，能夠感知和響應細胞膜的損傷，由PspABCD操縱子和PspG基因組成[8]，在大腸桿菌中的轉錄是由含有替代因子σ54的DNA依賴性RNA聚合酶驅動[9]，廣泛存在于臨床相關的如大腸桿菌（）、耶爾森氏菌（）和霍亂弧菌（）[10-12]等革蘭陰性細菌中。的表達是組成型表達，且可自我負調控，在細胞內低濃度表達，控制著操作子和的表達[13-16]。在大腸桿菌中，PspA與PspF蛋白相互結合形成抑制復合物，Psp系統處于沉默狀態，當細胞膜受到刺激，會導致PspA重新定位到細胞質膜，與PspBC復合，也可能通過直接的膜接觸，PspF誘導PspA表達，導致PspA、-B和-C濃度增加，PspA和PspD控制ArcB/ArcA系統的活性水平從而感知細胞的氧化還原/代謝狀態[17]，在細菌應激緩解中發揮作用。

目前，對Psp系統的研究報道主要集中在大腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌和霍亂弧菌（）等革蘭陰細菌[9-11]的結構功能及作用機理方面，對于哈維氏弧菌噬菌體休克蛋白系統中PspF蛋白的研究尚處于空白階段。本研究擬首次從哈維氏弧菌基因組擴增出基因，利用生物信息學分析初步分析其PspF蛋白表征，構建表達質粒菌株，優化表達菌株的表達條件，以期為哈維氏弧菌PspF蛋白作為亞單位疫苗的可能性研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 哈維氏弧菌菌株ZJ0603分離自患病斜帶石斑魚（）并保存于廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室。實驗中所用克隆載體為Takara pMD18-T，感受態細胞為北京全式金生物公司生產的大腸桿菌（）Transα和BL21（DE3），表達載體pET-28a由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒、Easy Pure PCR Purification Kit試劑盒和質粒提取試劑盒（Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit）購自賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司；Premix RxTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和QuickCut限制酶購自Takara公司；卡那霉素、氨芐青霉素、IPTG和TTBS購自海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1基因的克隆 參考細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取哈維氏弧菌ZJ0603的基因組。根據GenBank上已公布的弧菌基因序列，分別設計含HI和I酶切位點的上下游引物，上游引物F：5′-CGGGATCCATGAAGCAAAACC TCATCGGT-3′（HI），下游引物R: 5′-CCCTCG AGTTATCCT TGACCAACTAAGCCAT -3′（I）。以哈維氏弧菌的全基因組為模板鏈擴增基因，PCR反應體系為50 μL，反應條件為 95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53.2 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，34 個循環；72 ℃延伸10 min。擴增的目的片段用純化試劑盒純化，再將純化產物與載體pMD18-T連接，16 ℃連接2 h后轉化至感受態細胞transα，經無抗性的LB液體培養1 h后涂布于添加了質量濃度為100 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃倒置培養12 h，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，序列鑒定由廣州生工生物公司完成。

1.2.2生物信息學分析 在線網站NCBI ORF finder獲得目的基因的開放閱讀框和蛋白的氨基酸序列， ExPASy PASy-Prot分析PspF蛋白的理論等電點、疏/親水性情況、相對分子質量等理化性質；Signal P 4.1 Server測序預測PspF蛋白的信號肽的存在情況；Psort.hgc預測PspF蛋白的亞細胞定位；SOPMA和SWISS-MODEL分別分析其二級結構和三級空間結構，對氨基酸序列進行蛋白序列BLAST比對，ClustalW軟件分析其同源性。

1.2.3 表達載體pET28a-的構建 參照質粒提取試劑盒說明書對測序正確的pMD18T-和 pET-28a載體分別提取質粒用HI和I酶切后經T4連接酶連接后轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態中。經擴大培養后涂布平板，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，鑒定為陽性的菌落擴大培養后送廣州生工生物公司測序，保證新構建表達載體pET28a-在表達中不會發生移碼。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達 將含pET28a-重組質粒的大腸桿菌BL21（DE3）以體積分數1.0%接種量接種于LB液體培養基（含100 μg/mL kan+），37 ℃、200 r/min培養，每隔1 h測一次(600 nm)值。當(600 nm)達0.4~0.6時，向培養基中加1 mmol/L 誘導劑IPTG進行誘導表達，以不誘導的含pET28a-的 BL21（DE3）為對照組。37 ℃再次震蕩培養4 h后離心收集菌液，PBS洗凈后水煮法提取細菌蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析。

1.2.5 表達條件優化 采用控制變量法，分別在不同溫度、時間、異丙基---硫代半乳糖苷IPTG濃度條件下對重組菌株pET28a-的表達條件進行優化。

溫度：當（600 nm）值達到0.4~0.6，在20 ℃、37 ℃，IPTG濃度為1 mmol/L條件下誘導4 h后，4 ℃低溫離心收集15 mL菌液，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗并懸浮菌液，置于冰上超聲破碎細菌，超聲破碎程序設置為：功率300 W，超聲開時間4 s，超聲關時間8 s，超聲破碎約 20 min至菌液澄清透亮時即停止。4 ℃低溫離心后分裝上清和沉淀，用8 mol/L的尿素在4 ℃條件下溶解沉淀12 h，SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色并用Gel-pro Analyzer分析結果。。

時間：其他處理條件不變情況下，分別在誘導0、2、4、6、8和12 h時收集菌液，水煮法破碎蛋白后，離心取上清進行SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色并用Gel-pro Analyzer分析結果。

IPTG誘導濃度：其他處理條件不變情況下，IPTG誘導劑終濃度梯度設置為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L 進行誘導，水煮法破碎蛋白后，離心取上清進行SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色并用Gel-pro Analyzer分析結果。

1.2.6 Western blot分析 在最佳表達條件下誘導處理重組菌株，取上清進行His標簽純化融合蛋白，SDS-PAGE電泳后以低溫、200 mA、150 min條件轉移至聚偏氟乙烯PVDF膜，用塑料制的鑷子取出PVDF膜浸泡在含質量分數5%脫脂奶粉的封閉液中，浸泡條件為4 ℃、12 h，TTBS溶液清洗4次（10 min/次，后面步驟同）加鼠抗His-Tag單克隆抗體（體積比1∶1000稀釋）室溫搖晃孵育2 h，TTBS清洗加HRP-Tag山羊抗鼠IgG室溫搖晃孵育2 h，TTBS清洗后使用BAD顯色液在避光條件下顯色5 min，ddH2O終止反應并拍照觀察結果。

2 結果

2.1 PspF基因擴增及生物信息學分析

PCR擴增獲得特異條帶（圖1），條帶大小與預測的開放閱讀框大小一致。對該片段測序結果進行序列比對分析，發現其與其它弧菌的相似性較高，其中與歐文氏弧菌（）同源性高達96.13%，表明克隆得到的基因為基因。

M：DL2000 DNA 分子標準；1：PspF基因克隆產物

生物信息學分析發現哈維氏弧菌基因開放閱讀框ORF為981 bp，共編碼326個氨基酸，編碼的PspF蛋白理論分子質量為38.04 ku，理論等電點5.27，不穩定系數41.97，脂肪系數95.86，總平均親水性-0.382，表明該蛋白整體表現為親水性。該蛋白N端無明顯的信號肽切割位點，氨基酸序列含有2個蛋白激酶C磷酸化位點，7個酪蛋白激酶II 磷酸化位點，2個酪氨酸激酶磷酸化位，3個N端酰基化位點，3個微體C末端靶信號位點（第57 ~ 59位氨基酸），1個SIGMA-54相互作用結構域B特征ATP結合區和Sigma-54交互域C端標記部件，具體位置如圖2所示。

酪蛋白激酶 II 磷酸化位點為下劃線標記，蛋白激酶 C磷酸化位點為陰影標志，酪氨酸激酶磷酸化位點為下標波浪線，N端酰基化位點為方框標志，加粗代表微體C-末端靶信號位，首端ATG為啟動子，尾端* TAA為終止子

將PspF氨基酸序列分別使用SOPMA和SWISS-MODEL分析其二級結構和三級結構，其結果表明PspF蛋白中α-螺旋占45.24%，無規卷曲所占比38.99%，延伸鏈占比10.42%，β-轉角占比5.36%（圖3、4）。

藍色：α-螺旋；綠色：β-折疊；紫色：無規則卷曲；紅色：延伸鏈

圖4 PspF蛋白預測三級結構

2.2 重組表達載體pET28a-PspF的誘導表達

將基因與pET-28a連接后轉入表達菌株BL21（DE），測序后比對序列，結果發現構建的pET28a-沒有發生移碼，表明表達載體pET28a-成功構建。用1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導4 h后提取菌體蛋白，SDS-PAGE電泳分析結果表明，未誘導的質粒pET28a和pET28a-誘導前后沒有出現預期的表達蛋白條段，而用IPTG誘導的重組載體pET28a-表達得到一條約38 ku的蛋白條帶（圖5），證明基因在表達載體中成功表達。

M：100 ku蛋白分子標準；1、2：空載pET28a誘導前、后的全菌蛋白；3、4：pET28a-PspF重組質粒誘導前后的全菌蛋白

2.3 pET28a-PspF表達條件的優化

2.3.1 溫度對重組蛋白表達的影響 溫度優化結果表明表達載體pET28a-在20 ℃和 37 ℃條件下上清和包涵體中均有表達，且包涵體的表達均高于上清，在37 ℃條件下上清和包涵體蛋白表達量略高于20℃。

M：100 ku蛋白質分子標準；1：未誘導的全菌蛋白；2、3：溫度20 ℃誘導的可溶性蛋白和包涵體蛋白；4、5：溫度37 ℃下誘導的可溶性和包涵體蛋白

2.3.2 IPTG誘導時間對重組蛋白表達的影響 優化誘導時間結果表明，融合蛋白表達量隨誘導時間先增加后穩定，6 h時表達量達到最大后表達量不再升高，故選誘導時間為6 h。

M：100 ku蛋白質分子標準；1：未誘導的全菌蛋白；2―8：誘導0、2、4、6、8、10、12 h后融合蛋白的表達

2.3.3 IPTG誘導劑誘導濃度對重組蛋白表達的影響 PspF重組蛋白IPTG誘導濃度優化結果（圖8）表明，未誘導的全菌蛋白（泳道1）沒有發現融合蛋白的表達條帶，0.2~1.0 mmol/L IPTG誘導后均有目的蛋白條出現，且0.2 mmol/L時有較高的蛋白表達量，故最佳誘導濃度為0.2 mmol/L IPTG。

M：100 ku蛋白質分子標準；1：未誘導全菌蛋白；2―6：IPTG誘導濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L

綜合上述結果，pET28a-表達的最佳條件為37 ℃下IPTG濃度為0.2 mmol/L時誘導6 h。

2.4 Western blot分析

在37 ℃，0.2 mmol/L IPTG濃度的條件下對重組菌株和誘導6 h，將細胞破碎后取上清進行純化，Western blot結果如圖9，純化后誘導的重組菌株全菌蛋白出現單一目的條帶，且大小符合預測值，而未誘導重組菌株無條帶出現，說明而未誘導重組菌株無條帶出現，說明表達蛋白與His-Tag單克隆抗體結合，PspF蛋白表達成功。

M：蛋白質分子標準；1：純化后的上清蛋白；2：未誘導的全菌蛋白

3 討論

細菌通過監測自身的內部和外部環境，輔助以基因調控而大量繁殖。細胞內外部環境的唯一障礙是細胞膜和周質空間，其決定了細胞形態、能量產生、提供保護、同時保持對營養物質的滲透性，是許多其他重要細胞過程的場所[18-20]。在細菌侵入宿主體內后，面臨溫度、滲透壓和酸堿度的變化，從而導致細菌細胞包膜蛋白錯配和誤導，改變膜的性質，甚至破壞膜的滲透屏障。宿主會分泌膽汁鹽、其他表面活性劑和抗菌肽等物質攻擊細菌的細胞包膜。為了防止對細胞包膜的損傷，細菌有一種稱為胞質外應激反應（ESR）的信號轉導系統，用來監測膜室的完整性。ESR反應的研究大多為革蘭陰性細菌[19-20]，一旦啟動了ESR，細菌體內蛋白質就能恢復細胞內穩態的功能[21]。革蘭陰性菌具有許多特征性的ESR，包括σe、Cpx、Bae、Rcs和噬菌體休克蛋白反應（Psp）。Psp系統由操縱子和基因組成，在弧菌對抗宿主的免疫反應攻擊及適應宿主體內環境中發揮重要的作用。一般情況下，PspA與PspF蛋白相互結合形成抑制復合物，Psp系統處于沉默狀態，當膜破裂發生時，PspA重新定位到細胞質膜，與PspBC復合。也可能通過直接的膜接觸，PspF誘導PspA表達，由PspB和PspC感知，然后PspA釋放PspF，PspABC轉錄發生，產生保護反應[9-10, 21-22]。Psp反應最初是從F1絲狀噬菌體感染大腸桿菌時被發現[10]，隨后這種蛋白命名被為噬菌體休克蛋白A（PspA），并確定其產生是由噬菌體基因產物PIV誘導的[22]。隨著研究的深入，這種反應不僅限于噬菌體感染，許多其他應激源，如乙醇、熱、滲透性休克和固定相生長也是誘導物[22-25]。

本研究通過克隆哈維氏弧菌基因全長序列，該基因編碼的PspF氨基酸序列與其它弧菌的PspF相似性較高，其中與歐文氏弧菌（）同源性高達96.13%，三級結構預測顯示PspF蛋白和其他弧菌的PspF蛋白構型相似，因此推測哈維氏弧菌PspF蛋白具有抗弧菌共同抗原的潛力，但需要進一步進行原核表達、免疫原性和免疫保護性的驗證。本研究對原核表達進行條件優化，實驗結果表明，重組蛋白的表達和誘導條件有關，且包涵體表達的量比較大，其原因可能是新PspF多肽濃度較高，未及時在胞內進行折疊導致非結晶、無定形的蛋白質聚集形成包涵體[26]，表達量在低濃度的IPTG誘導下即可獲得較高表達，在誘導時間方面，表達量隨時間先上升后穩定，其可能因胞內某種酶的活性受到限制[27]。Western-blotting表明PspF 融合表達的蛋白與標簽蛋白His單克隆抗體相互結合，說明其成功表達。

目前，弧菌是海水經濟動物的常見致病菌之一，其對種類多、繁殖快，嚴重危害海水養殖業的發展。對于弧菌的治療主要采用抗生素的手段，但在長期大量使用抗生素會引發一系列問題，如耐藥菌株的產生[28]，破壞養殖微生態平衡[29]，殘留魚體的藥物會影響食用魚的安全等，因此，尋找代替途徑顯得尤為重要，而其中之一就是制備針對弧菌病的疫苗。

4 結論

本實驗克隆了哈維氏弧菌基因，得到1 179 bp堿基序列，與pET-28a（+）連接后，轉化入BL21（DE3）中構建了重組菌株。確定最優表達條件為37 ℃下，0.2 mmol/L 的 IPTG誘導6 h，表達蛋白為38 ku，通過生物信息分析后，其蛋白的同源性高，具有作為抗弧菌病疫苗的潛力。

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Cloning and Prokaryotic Expression ofGene from

MA Shao-hong, HUANG Yu-chong, JIAN Ji-chang, CAI Shuang-hu

（,//,524088,）

【】Thegene ofZJ0603 was cloned and expressed in prokaryotic, and the expression conditions were optimized. 【】Thegene instrain ZJ0603 was cloned, and its physical and chemical properties, signal peptide, subcellular localization, secondary structure and tertiary structure were analyzed. The expression vector pET28a and the PCR product of the amplified FspF gene were digested withHI andI. The pET28a-expression construct was produced after ligation of the digested vector and insert with T4 DNA ligase. The recombinant plasmid was transformed intoBL21(DE3), and the expression conditions of the recombinant strain were optimized and identified by Western Blot. 【】The open reading frame ofgene was 1179 bp in length, encoding 336 amino acids, the relative molecular weight and the theoretical isoelectric point was 38.04 ku and 5.27 respectively. The instability coefficient of the deduced protein were 41.97, and the total average hydrophilicity was -0.382. The optimal induction conditions for the expression of pET28a-were adding 0.2 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 6 h, and the expressed protein was 38 ku in size. Western Blot results showed thatrecombinant protein was successfully obtained. The protein has high homology and potential as an anti-Vibrio vaccine.

;gene; prokaryotic expression; expression optimization

S941.4；Q786

A

1673-9159（2019）05-0001-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.001

2019-05-10

廣東省科技計劃（2016A020209010）；廣東省自然科學基金（2017A0303030975）

馬少鴻（1994－），男，碩士研究生，研究方向為水生動物病害防控。E-mail：937025291@qq.com

蔡雙虎（1979—），男，教授，研究方向為水生動物病害防控研究。E-mail：cshcai@163.com

馬少鴻，黃郁蔥，簡紀常，等. 哈維氏弧菌基因的克隆及原核表達分析[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（5）：1-7.

（責任編輯：劉朏）