DMSO與DMF對H9C2心肌細胞毒性及STAT3信號通路的影響

楊 敏，張 凱，李建喜，王 磊，張 康，仇正英，王學智

(中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730050)

H9C2心肌細胞用于篩選臨床藥物時，常面臨藥物溶解度低的問題，因此篩選助溶劑是溶解藥物的關鍵一步。助溶劑必須滿足低毒、助溶效果優良、不改變藥物本身的特性。二甲基亞砜(DMSO)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為較常用的有機助溶劑。DMSO是一種廣泛使用的可溶于水的非質子溶劑，增溶能力強，低毒，具有透過生物膜的能力，可誘導細胞發生凋亡[1-2]。DMF則作為最有效的極性溶劑之一，有很好的溶解性，高沸點，低毒性，價格低廉，在有機合成、高分子制備、制藥等領域廣泛應用[3]。DMSO與DMF都具有低毒性，但對H9C2心肌細胞的毒性作用有待進一步研究。近年來發現信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)信號通路與心臟炎癥、血管再生、腫瘤、新陳代謝密切相關，調節細胞增殖、分化、凋亡過程，在炎癥反應中發揮作用，影響bcl-2、cyclinD1、matrix metalloproteinase-2基因轉錄活性[4-5]。當抑制STAT3活性時，可導致細胞凋亡，激活STAT3，進而抑制細胞凋亡[6]。DMSO與DMF對心肌細胞的毒性作用，可能與STAT3信號通路的調控相關。通過MTT法和Western blot試驗，檢測DMSO和DMF不同體積分數對H9C2心肌細胞的毒性作用與STAT3蛋白表達影響，以期為H9C2心肌細胞試驗藥物助溶劑的選擇提供參考，為研究H9C2心肌細胞的STAT3蛋白通路相關領域提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥物

DMEM培養基、胎牛血清、雙抗、0.25%的胰蛋白酶、無菌PBS，均購自美國Gibco公司；DMSO和DMF，購自美國SIGMA公司；MTT、彩虹180光譜蛋白Marker、5% BSA封閉液，均購自Solarbio公司；M-PER細胞裂解液，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Beta Actin Mouse McAb抗體，購自美國Proteintech公司；STAT3兔單克隆抗體，購自美國Cell Signaling Technology公司；Bcl-2兔多克隆抗體，購自美國Abcam公司；山羊抗鼠和山羊抗兔多克隆抗體，購自中杉金橋公司。

1.2 儀器

CO2恒溫培養箱，購自Heal Force廣州安邦生物公司；全自動細胞計數儀，購自美國 Nexcelom 公司；離心機，購自美國SIGMA公司；全波長酶標儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置顯微鏡，購自德國徠卡LEICA公司。

1.3 細胞來源

鼠源H9C2心肌細胞，購于中國科學院上海細胞庫。

1.4 H9C2心肌細胞培養

制備含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM細胞完全培養液，于-80 ℃取出H9C2細胞凍存管，立即放入37 ℃水浴，當心肌細胞完全融化后，加入DMEM細胞完全培養液，4 ℃，1 000 r·min-1，離心5 min后，棄去細胞液，加入DMEM細胞完全培養液，輕輕吹打底部細胞懸浮后，接種至75 mm2細胞瓶，37.5 ℃，5% CO2恒溫培養2～3 d。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，當平鋪細胞量為90%以上，進行細胞傳代，完全棄掉細胞液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，加入5 mL 0.25%的胰蛋白酶，37.5 ℃消化2 min，輕拍細胞瓶，促使細胞消化完全，加入10 mL含胎牛血清的細胞培養液終止消化，接種于新的細胞培養瓶培養。

1.5 配制不同體積分數的DMSO和DMF培養液

分別取10、20、30、50、70、90、100、200、300 μL的DMSO和DMF分別加入10 mL的DMEM高糖完全細胞培養液中，配比為0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%體積分數的DMSO與DMF細胞培養液，經0.22 μm·L-1的微孔濾膜過濾除菌后分別加入75 mm2細胞培養瓶培養。

1.6 細胞毒性試驗(MTT法)

將處于對數增長期的H9C2細胞制備為細胞懸液，以1×105mL-1的細胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL，培養24 h后，加入不同體積分數的DMSO和DMF，每孔重復5個平行試驗，共設置7列試驗組(加入含不同體積分數的DMSO和DMF)，2列對照組(細胞加培養液)，1列空白組(無細胞，只加細胞培養液)，圍繞試驗組、對照組、空白組外圈每孔加入100 μL無菌PBS，置于5% CO2的37.5 ℃恒溫培養箱培養。避光使用無菌PBS配制5 mg·mL-1的MTT溶液，經0.22 μm·L-1的微孔濾膜過濾除菌，試驗組、對照組和空白組每孔加入20 μL，在含5% CO2的37.5 ℃恒溫培養箱培養4 h后，徹底吸棄除無菌PBS孔的液體后，每孔加入150 μL DMSO，輕輕吹打幾下，低速振蕩10 min，置于酶聯免疫檢測儀中，設置吸收波長為450 nm，測定D值。6個96孔板重復相同操作，分別于24、48、72 h各取出一個96孔板，每個濃度實驗結果重復5次，取平均值計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組D均值-空白組D均值)/(對照組D均值-空白組D均值)×100。

1.7 Western blot檢測STAT3和Bcl-2蛋白表達

將H9C2細胞接種在75 mm2細胞瓶中，加入15 mL含有10% FBS和1%雙抗的DMEM，置于含5% CO2的37.5 ℃恒溫培養箱中。根據細胞毒性試驗(MTT法)結果，選取DMSO和DMF體積分數為0、0.2%、0.3%和0.5%加入75 mm2細胞培養瓶中，培養72 h后，取出細胞瓶放于冰盒上，每75 mm2中加入1 mL細胞裂解液，置于含5% CO2的37.5 ℃恒溫培養箱中孵育3 min，加入含10% FBS終止消化，在方形冰盒上使用細胞刮充分刮下貼壁的細胞，吸取細胞裂解液加入無菌1.5 mL EP管中，放于冰盒上。收集蛋白完畢后，平衡EP管后放于離心機，12 000 r·min-1離心10 min，取上清加入無菌1.5 mL EP管中，按照5-1樣品體積加5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴7 min，取出樣品放于-80 ℃保存。檢測目的蛋白STAT3和Bcl-2，先進行SDS-PAGE凝膠電泳，再半干轉膜，TBS洗滌3次，10 min一次，5% BSA封閉1 h，4 ℃分別孵育STAT3抗體和Bcl-2抗體(5% BSA分別稀釋抗體，比例均為1∶1 000)過夜，TBST充分洗滌3次，每次10 min，加入含辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(稀釋比1∶2 500)室溫振蕩1 h，TBST或TBS洗3次，每次10 min，將含目的蛋白的NC膜放入顯影儀，滴加顯影液(按照體積比1∶1配比)顯影，拍照記錄，以β-actin作為內參，使用Image J圖像分析軟件分析。

1.8 統計方法

采用SPSS 19.0進行統計學分析，以P<0.05和P<0.01分別作為差異顯著性和差異極顯著性判定標準。

2 結果與分析

2.1 細胞形態變化

觀察加入0.3% DMSO和DMF培養心肌細胞24 h后形態變化，細胞生長較為緩慢，部分出現凋亡，形態短縮、不規則，細胞懸浮等變化。隨著時間的延長，在48 h和72 h細胞貼壁數量減少，空泡、懸浮細胞量增加。

A和a為對照組(不含DMSO和DMF)；B、C、D分別為0.3% DMSO對H9C2心肌細胞作用24、48、72 h的細胞形態圖(5×和10×顯微鏡)；b、c、d分別為0.3% DMF對H9C2心肌細胞作用24、48、72 h的細胞形態圖(5×和10×顯微鏡)。A and a were control group (without DMSO and DMF); B， C， D， 0.3% DMSO on H9C2 cardiomyocytes for 24， 48， 72 h cell morphology map (5 × and 10 × microscope); b， c， d， 0.3% DMF on H9C2 cardiomyocytes for 24， 48， 72 h cell morphology map (5× and 10× microscope).圖1 0.3% DMSO和DMF對H9C2心肌細胞形態變化影響Fig.1 Effects of 0.3% DMSO and DMF on morphological changes of H9C2 cardiomyocytes

2.2 MTT法檢測細胞存活率變化

H9C2心肌細胞在DMSO和DMF不同體積分數作用下，通過MTT分別檢測24、48和72 h細胞存活率變化(表1和表2)，在DMSO和DMF體積分數為0.3%時，72 h對比48 h細胞存活率具有統計學意義(P<0.05)，并隨著DMSO體積分數的增加，細胞存活率逐漸下降。

2.3 Western法測定DMSO和DMF不同體積分數對STAT3蛋白表達的影響

檢測DMSO和DMF作用H9C2心肌細胞72 h后，STAT3和Bcl-2的蛋白表達變化。如圖3所示，與對照組比較，DMSO和DMF體積分數為0.3%和0.5%時，STAT3和Bcl-2蛋白的相對灰度值都具有統計學意義(P<0.01)，但DMF體積分數為0.2%，STAT3有統計學意義(P<0.01)，Bcl-2無統計學意義；DMSO體積分數為0.2%時，STAT3和Bcl-2與對照組比較均無統計學意義(P>0.05)。

表1MTT法檢測DMSO對心肌細胞存活率的影響

Table1Effect of DMSO on myocardial cell survival rate by MTT assay

DMSO體積分數Volume fractionof DMSO/%24 hD值D value存活率Survival rate/%48 hD值D value存活率Survival rate/%72 hD值D value存活率Survival rate/%00.618±0.010100.00±0.000.617±0.003100.00±0.3400.629±0.006100.00±0.5030.10.617±0.01099.56±1.530.604±0.01098.82±1.620.584±0.00997.91±1.050.20.601±0.05098.70±1.210.594±0.02198.28±1.200.573±0.01297.42±1.520.30.598±0.01195.76±1.50?0.576±0.00891.30±0.23?a0.538±0.00387.61±0.45?b0.50.587±0.01792.93±1.68?0.545±0.00686.33±0.81?a0.505±0.01080.29±1.09?b0.70.558±0.02590.22±1.21?0.520±0.00684.28±0.47?a0.477±0.00775.81±1.16?b0.90.543±0.01385.21±1.54?0.517±0.00478.20±0.69?a0.454±0.00471.27±0.58?b1.00.521±0.01079.44±0.078?0.503±0.00770.47±1.14?a0.426±0.00465.83±0.68?b2.00.453±0.01172.24±1.61?0.431±0.00464.75±0.68?a0.398±0.00755.32±0.99?b3.10.377±0.00861.00±1.30?0.355±0.00954.52±0.38?a0.309±0.00649.24±1.07?b

*，與對照組(不含DMSO)相比差異顯著，P<0.05；a，與24 h組相比差異顯著，P<0.05；b，與48 h組相比差異顯著，P<0.05。下同。

*， The significance compared with the control group (without DMSO)，P<0.05; a， The significance compared with the 24 h group，P<0.05; b， The significance compared with the 48 h group，P<0.05. The same as below.

表2MTT法檢測DMF對心肌細胞存活率的影響

Table2Effect of DMF on myocardial cell survival rate by MTT assay

DMF體積分數Volume fractionof DMF/%24 hD值D value存活率Survival rate/%48 hD值D value存活率Survival rate/%72 hD值D value存活率Survival rate/%00.601±0.034100.00±0.000.597±0.013100.00±0.000.612±0.034100.00±0.000.10.599±0.02198.72±1.450.583±1.1498.45±1.120.579±1.3498.23±1.560.20.576±0.12098.11±1.320.557±0.24597.91±1.350.521±1.1397.34±0.780.30.546±0.23097.01±0.34?0.510±0.06794.47±0.67?a0.498±0.14592.02±0.21?b0.50.532±0.07896.13±0.63?0.496±0.34785.03±1.47?a0.475±0.08380.79±0.44?b0.70.512±0.13294.65±0.56?0.479±0.08981.46±0.68?a0.456±0.05874.54±0.43?b0.90.491±0.89184.45±0.64?0.453±0.07878.09±0.34?a0.424±0.08165.03±0.33?b1.00.458±0.03180.67±1.12?0.421±0.00874.54±0.39?a0.398±0.00663.43±0.51?b2.00.401±0.06270.34±0.43?0.379±0.05760.57±0.64?a0.356±0.01752.54±0.60?b3.00.345±0.07865.78±0.31?0.358±0.09755.76±1.06?a0.321±0.01349.01±0.52?b

A、B，不同DMSO與DMF體積分數下STAT3和Bcl-2的Western blot結果圖；C、D、E、F分別為不同DMSO與DMF體積分數下STAT3和Bcl-2的相對灰度值；**表示與對照組對比差異顯著(P<0.01)。A， B， The Western blot results of STAT3 and Bcl-2 with different volume fraction of DMSO and DMF; C， D， E， F were the relative gray values of STAT3 and Bcl-2 with different volume fraction of DMSO and DMF；**， the significance compared with the control group (P<0.01).圖2 STAT3和Bcl-2相對表達量的變化Fig.2 Changes of relative expression of STAT3 and Bcl-2

3 討論

DMSO和DMF常被用作生物研究中的溶劑和藥物治療的載體，可與多種有機和無機物質完全混合，應用于治療疾病和科學試驗研究中，對不同細胞的毒性作用不可被忽略。有研究報道，DMSO對血液系統、兔視網膜上皮細胞等具有毒性作用，高濃度影響外周血單個核細胞(PBMCs)增殖和細胞因子分泌，在低濃度下降低T淋巴細胞的活性，抑制細胞的生長和細胞因子的分泌[7-11]，但體外試驗DMSO為0.1%～0.8%時作用大鼠心肌細胞6 h，對細胞活力無影響，抗氧化損傷作用機制與OH-1表達上調有關[12]，推測DMSO對心肌細胞損傷具有治療作用，體內試驗卻驗證DMSO對腦死亡的大鼠心肌細胞無治療作用，腦死亡(BD)所致大鼠心肌細胞凋亡作用機制與JNK信號通路的激活通過線粒體通路介導相關，線粒體凋亡通路受Bcl-2、caspase-3、Bax、Cyt-c蛋白影響[13]。DMF對消化系統、泌尿系統、心血管系統、生殖系統等具有損傷作用，主要通過皮膚和呼吸道感染。體外試驗DMSO對心肌細胞產生炎性損傷作用，受活性氧和NF-κB調控[14]。本研究發現，DMSO和DMF對H9C2心肌細胞具有不同程度的毒性作用，抑制細胞生長，隨著體積分數增加，細胞存活率逐漸降低，Bcl-2和STAT3蛋白表達均有下調，但當DMSO和DMF體積分數增加至0.5%時，STAT3表達上調，推測與機體平衡自身穩態相關，提示Bcl-2與STAT3蛋白可能共同調控DMSO和DMF對心肌細胞的凋亡機制。

Bcl-2家族分為抗凋亡和促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白Bcl-2在線粒體介導的凋亡中起著重要的調節作用，通過表達上調，抵抗細胞凋亡損傷，癌細胞常常依賴Bcl-2來保護自己不受凋亡的影響。眾所周知，Bcl-2蛋白的分布是一個決定細胞命運的動態過程。Bcl-2存在于線粒體、平滑的內質網(ER)、高爾基體、過氧化物酶體和細胞核中。Bcl-2主要定位于線粒體外膜，可抑制程序性細胞死亡，通過控制線粒體外膜通透性(MOMP)，在線粒體中保留細胞色素C，抵抗細胞凋亡損傷[15]。Bcl-2蛋白的過度表達可以抑制Bax和Bak的激活，阻止細胞色素C的釋放和caspase的激活共同改變細胞凋亡[16]。Bcl-2可抑制程序性細胞死亡，細胞淋巴瘤-2(bcl-2)家族的蛋白決定細胞的生命和線粒體自殺程序的凋亡，在程序性細胞死亡中，線粒體凋亡可能是最常見的形式，主要是去除多余的、感染的或受損的細胞[17]。線粒體是心肌細胞主要的能量供應，DMSO和DMF作用心肌細胞產生凋亡，檢測抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，心肌細胞線粒體發生凋亡，細胞出現程序性死亡。

信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)在多種細胞和組織中表達，是調節細胞增殖、凋亡和自噬等重要細胞過程的轉錄因子[18]。STAT3在幾種實體癌和血液病中的一個或兩個殘基中被組成性磷酸化，活化的STAT3從細胞質轉移到細胞核，與特定的啟動子序列結合，然后調節抗凋亡和細胞周期，調控基因產物(如Bcl-2、XIAP和cyclinD1)的轉錄激活，發揮抗凋亡作用[19-20]。DMSO和DMF可能通過降低心肌細胞STAT3發生磷酸化，抑制Bcl-2蛋白表達，使細胞存活率下降。