‘無子甌柑’CHS基因家族的克隆和表達分析

俞狄虎，張 遲,，柯甫志，敬露陽，顧雪嬌，吳寶玉，張 敏

（1.浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 杭州311300；3.浙江省柑橘研究所，浙江 臺州318020；4.浙江省麗水市蓮都區農業技術推廣中心，浙江 麗水323000）

雄性不育在開花植物中普遍存在，主要表現為雄蕊發育不正常，不能產生具有正常功能的花粉［1］。‘無子甌柑’Citrus suavissima‘Seedless’是甌柑Citrus suavissima的芽變品種，保留了甌柑肉質飽滿、香味特異、耐儲藏的優良品質，因果實無核被人們青睞。研究認為，雄性不育是 ‘無子甌柑’無核的重要原因之一［2］。張遲等［3］發現 ‘無子甌柑’花粉敗育始于小孢子母細胞時期，推測其雄性不育與能量代謝異常和營養物質缺乏有關。對矮牽牛Petunia hybrid［4］，枸杞Lycium barbarum［5］，辣椒Capscum annuum［6］和蘿卜Raphanus sativus［7］等植物的研究發現， 查爾酮合成酶基因（CHS）的異常表達會引起雄性不育；CHS是黃酮類化合物代謝通路中的關鍵基因，通過影響查爾酮的產生從而影響黃酮類化合物的生物合成［4］，而黃酮類化合物的缺乏/過量是植物雄性不育的重要原因之一。有研究將克隆自10個柑橘種質的CHS基因與溫州蜜柑 ‘國慶4號’Citrus unshiu‘Guoqing 4’， 柚 ‘馮威’Citrus maxima‘Fengwei’和甜橙 ‘紅寶石’Citrus sinensis‘Ruby’的CHS比對，發現不同品種柑橘的CHS基因編碼區核苷酸序列相似度極高，達98%以上［8］。本研究以前期工作為基礎，以克里曼丁橘Citrus clementina數據庫為參照，對 ‘無子甌柑’和甌柑小孢子母細胞時期的花藥進行轉錄組和蛋白質組測序，篩選CHS同源差異表達基因進行克隆和表達量分析，并對CHS基因家族進行生物信息學分析，以期為 ‘無子甌柑’雄性不育機理的深入研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 數據源 ‘無子甌柑’和甌柑小孢子母細胞時期的花藥轉錄組測序數據源自課題組上傳的NCBI數據（NCBI登錄號 PRJNA430695）。

1.1.2 材料 ‘無子甌柑’和甌柑采自浙江省麗水市富嶺街道南寨自然村，采樣時間參照前期研究［9］。采集 ‘無子甌柑’和甌柑成熟時期的花蕾進行基因克隆。采集兩者小孢子母細胞時期（Ⅰ，花蕾直徑2.0～2.4 mm）、減數分裂時期（Ⅱ，花蕾直徑2.4～2.8 mm）和四分體時期（Ⅲ，花蕾直徑 2.8～3.1 mm）的花藥，用于分析不同發育時期的基因表達量。采集兩者成熟花粉粒時期花蕾（花蕾直徑6.5～6.9 mm）的4個不同部位（花藥、花絲、雌蕊和花瓣），用于分析不同部位的基因表達量。所有材料均保存于-80℃。

1.2 基因克隆和基因表達量分析

利用RNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa）提取甌柑、 ‘無子甌柑’不同發育時期的花藥和成熟花粉粒時期花蕾不同部位的RNA，并對RNA樣品質量進行檢測。按反轉錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）說明書，將得到的RNA反轉錄成cDNA，并于-20℃保存。

以克里曼丁橘基因組數據庫為參考，對小孢子母細胞時期 ‘無子甌柑’和甌柑的花藥進行轉錄組和蛋白質組分析，鑒定得到CHS基因家族成員；以差異表達倍數（FC）＞1.2，錯誤發現率（FDR）＜0.01為標準［10］，篩選到CHS同源差異表達基因；以差異表達倍數（FC）＞1.2，假設概率（P）＜0.05為標準，篩選CHS同源差異表達蛋白。

對得到的差異表達CHS基因進行克隆及定量引物設計。對 ‘無子甌柑’和甌柑的CHS基因的蛋白質編碼區（CDS,Coding Sequence）進行克隆。聚合酶鏈式反應（PCR,Polymerase Chain Reaction）程序為95℃，5 min；95℃，30 s，56℃，40 s，38個循環；72℃，10 min。PCR產物在質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳。利用膠回收試劑盒（TaKaRa）純化膠回收產物并連接到pMD-18質粒（TaKaRa），轉化感受態大腸埃希菌Escherichia coliDH5α（TaKaRa）中，37℃震蕩培養后涂板挑菌。通過菌液PCR及電泳檢測后，選出條帶大小正確的菌液送生工生物工程（上海）有限公司測序，獲得基因的核苷酸序列。

以克里曼丁橘序列為模板，在線設計qRT-PCR特異性引物（https://www.genscript.com），以甜橙Citrus sinensis的Actin基因（GU911361）［9］為內參基因，引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。利用CFX96 real-time system實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad）及熒光染料SYBRPremix ExTaqTMⅡ（TaKaRa）說明書進行實時定量PCR，反應程序為95℃，30 s，95℃，5 s，57℃，30 s，39個循環，65～95℃升溫檢測擴增產物的溶解曲線［9］。設置3個重復，根據2-△△Ct方法，以甌柑小孢子母細胞時期花藥的表達量為基準計算基因相對表達量［11］，比較 ‘無子甌柑’和甌柑在花藥不同發育時期和花粉粒成熟期花蕾不同部位的基因表達量。

1.3 CHS基因家族生物信息學分析

柑橘CHS基因編碼區核苷酸序列相似度極高［8］，因此以克里曼丁橘為例開展CHS基因及蛋白質的生物信息學分析。登錄克里曼丁橘數據庫，下載CHS基因全長序列、基因CDS序列、家族蛋白序列等信息。所有蛋白質序列通過在線數據庫ExPASY（https://web.expasy.org/protparam）進行蛋白生理生化分析。基于已有報道［12］，利用CELLOv2.5進行亞細胞定位。通過在線數據庫Prabi（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進行蛋白二級結構分析。利用MEGA6.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建克里曼丁橘（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Cclementina）、甜橙（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Csinensis）、擬南芥Arabidopsis thaliana（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Athaliana）和水稻Oryza satava（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Osatava）的CHS同源蛋白系統進化樹，設置Bootstrap值為1000，去除支持率低于50%的節點，并顯示各分支長度。

表1 ‘無子甌柑’CHS基因家族成員及其小孢子母細胞時期相對表達量Table 1 CHS gene family and expression in C.suavissima ‘Seedless’ at microsporcyte

表2 基因克隆引物Table 2 Sequences of primer for gene cloning

2 結果與分析

2.1 CHS基因家族成員的鑒定和克隆

對小孢子母細胞時期的 ‘無子甌柑’和甌柑花藥轉錄組和蛋白質組數據分析，共得到10個CHS同源基因（表1）；轉錄組測序結果滿足差異表達倍數＞1.2且錯誤發現率＜0.01的有3個基因（Ciclev10005133m，Ciclev10001405m，Ciclev10030093m），蛋白質組測序結果滿足差異表達倍數＞1.2且假設概率＜0.05標準的有1個基因（Ciclev10015535m）。得到的4個差異表達CHS基因引物序列如表2。qRT-PCR特異性引物序列如表3。

表3 qRT-PCR引物Table 3 Sequences of primer for real-time PCR

對克隆得到的 ‘無子甌柑’和甌柑的CHS同源基因序列（CsCHS）進行比對，結果發現：Ciclev10015535m，Ciclev10005133m和Ciclev10030093m在甌柑和 ‘無子甌柑’間存在核苷酸序列變異，但僅Ciclev10030093m在編碼氨基酸水平發生了改變（表4）。

表4 甌柑和 ‘無子甌柑’的CHS同源基因Table 4 Alignments of CsCHS nucleotide sequences between Citrus suavissima ‘Seedless’ and C.suavissima

2.2 CHS基因家族成員的表達分析

圖1表明：小孢子母細胞時期， ‘無子甌柑’與甌柑相比Ciclev10005133m，Ciclev10030093m和Ciclev10015535m顯著下調，Ciclev10001405m顯著上調；減數分裂時期，Ciclev10005133m，Ciclev10001405m和Ciclev10015535m顯著下調；四分體時期，Ciclev10001405m和Ciclev10030093m顯著下調，Ciclev10005133m顯著上調。

圖1 ‘無子甌柑’和甌柑CHS基因在花藥發育過程中的基因表達分析Figure 1 Expression level of anther in different development stages in C.suavissima ‘Seedless’ and C.suavissima

由圖2可知：成熟花粉粒時期， ‘無子甌柑’和甌柑的花絲中CHS基因表達量相仿。花藥中Ciclev10001405m和Ciclev10005133m表達量顯著高于其他花器官；Ciclev10030093m，Ciclev10005133m和Ciclev10015535m的表達在 ‘無子甌柑’和甌柑的花藥中存在顯著差異，可能會引起該時期 ‘無子甌柑’和甌柑的花藥中黃酮含量的差異。總的來說，花藥中Ciclev10001405m表達量遠高于花瓣、雌蕊和花絲，推測Ciclev10001405m的表達在花藥中具有特異性。

圖2 ‘無子甌柑’和甌柑花蕾不同部位的CHS基因的相對表達量Figure 2 Expression of CHS genes among different floral organs in C.suavissima ‘seedless’ and C.suavissima

2.3 CHS基因家族的生物信息學分析

2.3.1CHS基因家族成員鑒定 克里曼丁橘基因組數據庫共鑒定到13個CHS基因家族成員。對CHS蛋白質理化性質的分析表明：編碼的氨基酸數量最少的是Ciclev10003127m（309個），最多的是Ciclev10001395m（396個）；平均等電點為6.12，所有蛋白質均為酸性蛋白。相比之下， ‘無子甌柑’和甌柑中，Ciclev10005133m（390個）編碼的氨基酸數量最少，Ciclev10001405m（395個）編碼的氨基酸數量最多；平均等電點為6.27（表5）。亞細胞定位結果表明：這些CHS蛋白都分布在細胞質中，說明CHS蛋白在細胞中的分布具有特異性。蛋白質二級結構分析表明：α-螺旋比例和數量均最高，β-轉角則相對較少；表現為α-螺旋數量＞無規則卷曲數量＞延伸鏈數量＞β-轉角數量。 ‘無子甌柑’與甌柑中篩選的4個CHS蛋白也表現出相似趨勢（表6），推測α-螺旋在蛋白質二級結構中起主導作用。

表5 CHS基因及其表達Table 5 Basic information of CHS genes and proteins

2.3.2 CHS家族同源蛋白系統進化樹構建 現有研究篩選到克里曼丁橘13個CHS蛋白、甜橙7個CHS蛋白、擬南芥4個CHS蛋白和水稻3個CHS蛋白。按照遺傳距離可以將CHS蛋白聚類為5個亞家族（圖3）。GroupⅠ包含3個擬南芥CHS蛋白和2個水稻CHS蛋白。GroupⅡ包含5個克里曼丁橘CHS蛋白和3個甜橙CHS蛋白。GroupⅢ包含2個克里曼丁橘CHS蛋白。GroupⅣ包含3個克里曼丁橘CHS蛋白和3個甜橙CHS蛋白。GroupⅤ包含上述4個物種的CHS蛋白成員。其中Ciclev10005133m蛋白和Ciclev10015535m蛋白均聚類于GroupⅤ，Ciclev10030093m蛋白和Ciclev10001405m蛋白則分別聚類于GroupⅡ和GroupⅣ。

表6 CHS蛋白二級結構分析Table 6 Secondary structure analysis of CHS proteins

3 討論與結論

查爾酮合成酶（CHS）催化丙二酰-CoA和香豆酰-CoA結合形成查爾酮，是黃酮類化合物代謝通路（ko00941）中的第1個限速酶；查爾酮是各種黃酮類化合物的基本骨架，其數量異動會影響黃酮類化合物的形成，進而造成花藥顏色、形態異常［4-5］。一般認為黃酮類化合物是柑橘具有高抗氧化性和良好藥用功效的原因［8］；矮牽牛CHS突變后花藥顏色由黃色變成白色，花藥功能異常，引起雄性不育［4］；枸杞CHS的下調表達會影響花藥功能，造成枸杞雄性不育［5］；水稻中CHS的過量表達會引起花藥表面色素大量沉淀，造成水稻雄性不育［13］。

圖3 4個物種CHS蛋白系統進化樹Figure 3 Phyogenetic trees of CHS proteins from four species

CHS基因家族中成員不多，不同植物中數量也不同。如：擬南芥基因組數據庫中僅鑒定到4個同源基因，大豆Glycine max［14］中略多（8 個）。 對已篩選的 CHS 同源基因的研究發現［13］：X89859.1基因與水稻絨氈層的發育極其緊密，而后者發育正常與否直接關系著花粉的育性［15］。本研究在CHS蛋白系統進化樹分析中發現，柑橘CHS同源蛋白Ciclev10005133m和水稻CHS同源蛋白X89895.1聚類于Group V，推測兩者具有相似的功能。在 ‘無子甌柑’中，Ciclev10005133m同源基因在小孢子母細胞至減數分裂時期的表達顯著低于甌柑，因此，Ciclev10005133m同源基因的異常表達可能對 ‘無子甌柑’小孢子母細胞發育過程產生不利影響。此外，Ciclev10015535m和Ciclev10030093m同源基因的表達也在小孢子母細胞時期出現顯著下調，因此，CHS同源基因起始于小孢子母細胞時期的下調表達可能成為后期 ‘無子甌柑’小孢子敗育的重要原因。

本研究以克里曼丁橘數據庫為基礎，從 ‘無子甌柑’和甌柑的轉錄組和蛋白質組數據中篩選出4個CHS同源差異表達基因，其核苷酸序列在 ‘無子甌柑’和甌柑中的相似度達到98%，并且3個同源基因在 ‘無子甌柑’中表達的顯著下調起始于小孢子母細胞時期。CHS的異常表達可能是 ‘無子甌柑’小孢子發育異常從而造成雄性不育的原因。