不同光周期和溫度處理下桂花內參基因的篩選

王千千，蔣琦妮，付建新，董 彬，趙宏波

（浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州，311300）

桂花Osmanthus fragrans是中國十大傳統名花之一，深受人們喜愛。不同學者已經從桂花的花芽分化［1-3］、 開花機制［4-5］、 花色呈現［6-7］、 花香釋放［8-9］等不同層面展開了研究。 隨著分子水平研究的不斷深入，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析基因的表達已成為研究這些過程機理的重要手段，而篩選得到適合不同研究的內參基因格外重要。研究認為［10-11］，內參基因并不存在通用性，不同處理、不同組織中內參基因的表達水平都會發生改變［12］；選用一種內參基因無法準確反映不同植物組織、同一組織不同處理下的基因表達水平［13-14］。因此，根據具體的實驗材料和處理條件篩選合適的內參基因十分必要［15］。光周期和溫度處理能對桂花的基因表達水平、花芽分化進程等產生影響。研究表明［4，16］：長日照和相對低溫都能夠加快桂花花芽分化進程，而短日照條件下桂花的花芽分化相對較慢，低溫或高溫都會抑制桂花的花芽分化。本研究在不同光周期和溫度條件下對桂花常用的7個候選內參基因進行比較分析，篩選最佳內參基因，為后期研究光周期和溫度影響桂花開花的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為多年生 ‘佛頂珠’O.fragrans‘Foding Zhu’盆栽植株，種植于浙江農林大學桂花資源圃。設置4個處理：長日照高溫（光照/黑暗=14 h/10 h，26℃），長日照低溫（光照/黑暗=14 h/10 h，19℃），短日照高溫（光照/黑暗=10 h/14 h，26℃）和短日照低溫（光照/黑暗=10 h/14 h，19℃），光照強度為100%，相對濕度為60%～80%。實驗材料在上述環境中培養40 d。處理結束后從8:00起，每隔4 h取當年生枝條的第2片或第3片嫩葉，液氮速凍，放于-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 每樣品取50～100 mg，充分研磨后按照RNAprep pure Plant Kit（天根，北京）說明書步驟提取各樣品RNA。通過紫外分光光度計和質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA濃度和品質。以所提樣品RNA為模板，按照Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大連）說明書合成cDNA第1條鏈，合成后于-20℃儲存備用。

1.2.2 候選內參基因的選擇和特異性引物設計 從桂花轉錄組數據庫中選擇肌動蛋白基因（OfACT）、延伸因子1α蛋白基因（OfEF1α）、NADP-異檸檬酸脫氫酶基因（OfIDH）、GTP結合蛋白RNA1基因（OfRNA1）、β 微管蛋白基因（OfTUB）、 泛素結合酶 E2 基因（OfUBC2）和 18S 核糖體 RNA 基因（Of18S）［12，17］等7個使用較多的內參基因作為候選內參基因。采用SYBR greenⅡ熒光染料嵌合法進行內參基因的篩選，設計候選內參基因的引物，通過Bioxman和Primer Premier 5軟件對引物進行校驗，并利用Primer-BLAST進行檢測以確認引物序列的特異性。選用的引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。

1.2.3 熒光定量PCR分析 qRT-PCR實驗方法參考SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（Takara，大連）試劑盒。采用20.0 μL的反應體系：其中雙蒸水 6.4 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，SYBRⅡ熒光染料10.0 μL。反應在ABI 7300實時PCR儀中進行，反應程序為：95℃下預變性30 s；95℃下反應 5 s，60℃反應 31 s，共40個循環；95℃下反應15 s，60℃下反應 1 min，95℃下反應30 s， 60 ℃下反應 15 s［17］。 3次生物學重復。

1.2.4 數據分析 用geNorm，NormFinder和BestKeeper軟件分別對qRT-PCR中所得到樣品的反應循環數（Ct值）進行分析，比較7個候選內參基因表達的穩定性，并選擇最佳內參基因。geNorm軟件以各候選內參基因在樣品中的表達水平為依據，計算各候選基因的表達穩定性（M），M值越小越穩定；M＜1.5時認為是理想內參［18-19］。geNorm軟件還可以根據候選內參基因標準化因子的配對差異性分析（Vn/Vn+1）得出最佳內參基因的個數；其中V表示配對差異值，n表示內參基因個數。軟件默認的（Vn/Vn+1）值為0.15，當Vn/Vn＋1＜0.15時，表明引入的n個內參基因已經穩定，不需要引入（n＋1）內參基因，當Vn/Vn＋1＞0.15時，則需要引入（n＋1）個內參基因［17，20］。因geNorm軟件最終挑選出2個或2個以上的內參基因組合來校正數據，所以n≥2。為了了解引用1個內參基因的穩定性，需要通過NormFinder和BestKeeper軟件做進一步分析。NormFinder軟件對內參基因的篩選是基于方差分析的結果，利用△Ct法計算候選內參基因表達的穩定值（S），從而評估候選內參基因的表達穩定性；S越小，基因越穩定［21］。BestKeeper軟件通過計算標準偏差（SD）對候選內參基因的表達穩定性進行評價和排序，SD越小，則該基因的穩定性越好；若SD＞1，則認為該基因不穩定［20-21］。最后通過晝夜節律基因GI的相對表達水平，對選擇的最佳內參基因進行驗證。

表1 qRT-PCR相關內參基因引物信息Table 1 List of primers for qRT-PCR

2 結果和分析

2.1 RNA品質及引物擴增效率檢測

提取不同處理桂花樣品的總RNA，經紫外分光光度計檢測，所有樣品總RNA的吸光度值［D（260）/D（280）和D（260）/D（230）］均為1.8～2.1。將所有樣品的cDNA等量混合后作為模板，進行普通PCR和定量PCR檢測。為檢測引物的擴增效率，設置6個cDNA濃度梯度（原液，5-1，5-2，5-3，5-4，5-5原液），根據qRT-PCR結果，利用公式E=（10-1/s-1）×100%得出基因的擴增效率（表2），其中：E（%）表示擴增效率，s表示曲線斜率。經計算，擴增效率為95%～110%，相關系數為0.993～0.998，符合qRT-PCR的基本要求。

2.2 候選內參基因的轉錄水平分析

根據擴增效率，將各樣品的原始cDNA稀釋50倍后作為模板進行qRT-PCR。通過比較循環數（Ct）來評估各候選內參基因在所有樣品中的轉錄水平（表2），候選內參基因平均Ct為8.99～28.44，其中Of18S的Ct最小，說明平均表達水平最高；OfTUB最大，說明平均表達水平最低；其他候選內參基因平均表達水平差異則相對較小。

2.3 內參基因表達穩定性分析

geNorm軟件分析發現（表3），所有候選內參基因的穩定值均小于1.5，符合內參基因篩選的標準；其中OfRAN1和OfIDH的穩定值相等且最小（M=0.347），在不同樣品中表達最為穩定，其次是OfACT基因（M=0.393），Of18S穩定值最大（M=0.601），說明Of18S表達穩定性最差。對候選內參基因的配對差異值測算可知（圖1）：V2/3=0.126＜0.15，表明引入2個內參基因已經穩定，無需引入更多的內參基因。geNorm軟件分析結果表明，最佳候選內參基因為OfRAN1和OfIDH。

表2 7個候選內參基因擴增參數Table 2 Amplification parameters of seven candidate reference genes

NormFinder軟件分析發現，OfRAN1基因的表達穩定性最高，其次是OfIDH，Of18S基因表達穩定最差，與geNorm軟件分析的結果一致（表3）。BestKeeper軟件的分析結果顯示（表3），在7個候選內參基因中，OfIDH基因的表達穩定性最高，其次是OfRAN1，Of18S基因的表達穩定性最差。分析結果盡管與geNorm和NormFinder軟件的結果有些差異，但最佳候選內參基因結果一致。

表3 不同軟件分析7個候選內參基因表達穩定性Table 3 Gene expression stability of seven reference genes by different software

綜合3個軟件的分析結果可以得出，不同處理條件下，OfRAN1和OfIDH的表達穩定性均為最高，可作為最佳內參基因，而Of18S是表達穩定性最差的基因。

圖1 geNorm軟件分析候選內參基因的配對差異值Figure 1 Pairwise variationof candidate reference genes as calculated by geNorm

2.4 桂花GI基因對最佳內參基因穩定性的驗證

GIGANTEA基因（GI）是光周期途徑的重要調控基因，其表達呈現明顯的晝夜節律。選用桂花晝夜節律相關基因GI對候選內參基因進行驗證，可提高內參基因篩選的準確性，保證最佳內參基因對光周期途徑基因表達水平的校準作用。選擇OfRAN1/OfIDH，OfRAN1，OfIDH以及其他候選內參基因對GI基因的相對表達水平進行校準（圖2），結果顯示：相比其他內參基因，不同處理下OfRAN1/OfIDH校準的GI基因的表達模式表現為光照條件下積累，黑暗條件下降低的周期性表達，符合GI基因的晝夜表達規律。說明3個內參基因篩選軟件對候選內參基因篩選的結果是正確的，即OfRAN1和OfIDH基因可作為桂花不同光周期和溫度處理的最佳內參基因。

3 討論

熒光定量PCR因其眾多優點被廣泛運用于基因表達的研究中，成為量化基因轉錄表達，揭示基因表達規律的有效方法［22-23］；但引用適當的內參基因對qRT-PCR的結果進行校準是非常必要的［20］。理想內參基因在不同組織、不同發育階段、不同生長條件下均能穩定表達［17，24］，但事實上并沒有哪一個基因能夠滿足所有條件［25］。因此，根據不同實驗材料和處理條件，篩選出合適的、特定的內參基因是確保實驗成功的必要條件。

圖2 不同內參基因或組合校正桂花不同條件下GI基因的相對表達Figure 2 Relative expression levels of GI in different conditions using different reference genes or reference gene combination for normalization

研究發現［26］：選用2個或更多內參基因組合可以提高內參基因校準的精確度，弱化單一內參基因帶來的不準確性。RAN（ras-related nuclear protein）是小G蛋白的一類，在細胞生理進化中起到重要的作用，它的很多同源基因是不同光周期、溫度條件下常用的內參基因［12，17］。IDH的同源基因被證實為不同溫度條件下桉樹Eucalyptus robusta的最佳內參基因［27］；ACT和18S同源基因分別可作為不同光周期［28］、溫度條件［29］下大豆Glycine max的內參基因；EF1a和TUB基因可作為不同光周期、溫度條件下玉米Zea mays的內參基因［30］；UBC2的同源基因可作為不同溫度條件下歐芹Petroselinum crispum的內參基因［31］。本研究選用了桂花中常用的7個候選內參基因，對其在不同光周期和溫度處理下嫩葉中的表達穩定性進行研究；利用geNorm，NormFinder和BestKeeper等3個常用于內參基因篩選的軟件進行評估，發現這7個候選內參基因在所有樣品中表達穩定性的排序基本相同，均顯示OfRAN1和OfIDH基因是最穩定的2個內參基因，將兩者進行組合可以準確的校準不同處理下桂花葉片中目的基因的表達水平；而Of18S表達最不穩定，在所有實驗材料中都存在較高的表達豐度，因而不適合作為本研究的內參基因。

光周期和溫度途徑在調控植物成花過程中發揮重要作用。篩選得到的桂花不同光周期和溫度條件下的內參基因，能夠為研究桂花在不同溫度和光周期處理條件下的成花機制提供參考依據，為了解相關成花基因表達模式提供保障。