液相色譜質譜法測定螢火蟲熒光素

李東芹

摘要[目的]建立快速測定D-蟲熒光素的液相色譜-質譜（HPLC-MS/MS）分析方法，并對熒光素的碎裂機理進行解析。[方法]采用Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱，甲醇、水梯度洗脫12? min進行色譜分離;在質譜正離子模式下，用6對反應監測離子對（MRM）進行定性、定量分析。[結果]目標化合物在0.625～125.000 μg/L線性關系良好（r=0.996 9），檢出限為0.250 μg/L（S/N為5）。[結論]該方法靈敏度高、選擇性好，不僅可用于螢火蟲發光機理、發光強弱差異、發光顏色差異方面的研究，還可以用于其他需要定量測定熒光素的研究。

關鍵詞 液相色譜-串聯質譜;快速分析;D-熒光素鉀鹽;螢火蟲;熒光素

中圖分類號 S-03文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0191-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.052

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract[Objective]A rapid high performance liquid chromatographymass spectrometry（HPLCMS/MS）method was developed for the determination of DLuciferin.The DLuciferin fragmentation mechanism was analyzed.[Method]The HPLC separation was carried on the shimpack VPODS column（150 L×2.0 mm，5 μm） with methanol and water eluting gradiently in 12? min.The DLuciferin was detected by using 6 multiple reaction monitoring （MRM） in ESI positive mode of mass spectrometer.[Result]There was a good linear relationship within the range of 0.625-125.000 μg/L（r=0.996 9）.The quantitative determination limit was 0.250 μg/L（S/N=5）.[Conclusion]The method is sensitive and selective. It can be used to detect DLuciferin rapidly in the firefly or other research .

Key words HPLCMS/MS;Rapid analysis;DLuciferin;Firefly;Luciferin

作者簡介 李東芹（1978—），女，安徽泗縣人，實驗師，碩士，從事大型儀器分析與實驗技術研究。

收稿日期 2019-03-06

螢火蟲屬鞘翅目螢科，是螢科昆蟲的通稱，因其尾部能發出螢光，故名為螢火蟲。螢火蟲的發光是其體內熒光素在熒光素酶催化下發生氧化反應所釋放的能量形成的。不同品種、不同性別和不同生長時期的螢火蟲，其發光部位、發光強弱、發光顏色又有很大的差異[1-2]。現有對螢火蟲發光機制的研究一般集中在熒光素酶的活性、穩定性、立體結構影響發光顏色等方面[3-7]，而對螢火蟲熒光素的研究非常少。除了少量螢火蟲熒光素人工合成[8-10]方法報道外，關于螢火蟲熒光素的定量測定方法鮮見報道。已報道的熒光素類物質，如熒光素鈉、熒光黃、熒光桃紅等的測定方法有熒光分光光度計法[11]、拉曼光譜法[12]和高效液相色譜法[13-14]等，這些分析方法理論上也可以用于螢火蟲熒光素的測定，但是靈敏度和選擇性相對較差。筆者利用液相色譜質譜高靈敏和高選擇性的特點，建立螢火蟲熒光素的定性、定量分析方法。

1 材料與方法

1.1? 試材 4000Qtrap 串聯三重四級桿線性離子阱質譜儀（美國AB Sciex公司）; LC-20AD高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;Milli-pore 超純水儀（美國Millipore公司）; 蠕動泵（Hamilton 公司）;離心機（貝克曼公司）。甲醇（色譜純，默克公司）;超純水; 乙酸（色譜純）;1 mL醫用注射器;022 μm微孔濾頭（上海安普）;D-蟲熒光素鉀鹽（上海前生生物有限公司）;穹宇螢樣品（華中農業大學付新華老師提供）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備。

精確稱取螢火蟲尾部組織，液氮研磨后加1 mL 95 ℃熱水勻漿萃取15 min，離心取上清500 μL，加500 μL正己烷，混勻后靜置分層，取下層水溶液經0.22 μm微孔濾頭過濾后上機分析。

1.2.2 儀器條件。

1.2.2.1 色譜條件。島津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱，樣品室溫度為室溫;流動相：A為01%的乙酸水溶液，B為含2 mmol/L醋酸銨的甲醇溶液;流速為0.25 mL/min ，柱溫箱溫度為室溫，進樣量為5 μL。梯度洗脫條件為：B∶A，0 min 為15∶85（V/V），5 min 為 100∶0（V/V），8 min 為100∶0（V/V），8.1 min為15∶85（V/V），12 min程序結束。

1.2.2.2 質譜條件。采用電噴霧（ESI）離子源，在正離子電離模式下選用多反應離子監測（MRM）掃描模式進行定量分析。電噴霧電壓5 500 V;離子源溫度：500 ℃;離子源輔助氣GS1/GS2氣流均為50 L/h。質量掃描范圍m/z 50～300，二級質譜碰撞能量：31eV。

2 結果與分析

2.1 質譜參數優化

用蠕動泵直接進樣，對500 μg/L的熒光素鉀鹽標準品溶液進行母離子全掃描，在陽離子模式下得到熒光素鉀鹽的[（M-nK）+（n+1）H]型母離子為281.1;優化電壓、離子源溫度和輔助氣等參數使分子離子峰最強;在以上質譜條件下，對選定的母離子進行子離子掃描，得到熒光素鉀鹽的二級質譜碎片離子（圖1）;繼續對解簇電壓（DP）、入口電壓（EP）、碰撞能量（CE）和碰撞出口電壓（CXP）等質譜參數進行優化，在DP為90 V、EP為10 V、CE為31 V、CXP為10 V條件下，熒光素的母離子、子離子信號強度比例適中;選取豐度最大的子離子235.2與母離子組成MRM定量離子對（281.10→235.2，選177.2、194.2、876、105.3、203.0 子離子與母離子組成5個輔助定性離子對。

2.2 熒光素的質譜裂解方式

根據圖1熒光素在正離子模式下的離子碎片信息，推測可能存在以下3種主要的碎裂方式（圖2）。熒光素鉀鹽的準分子離子峰[（M-nK）+（n+1）H]為m/z 281.1，脫去一個羧基后得到m/z 235.2的碎片離子;2位的碳氮鍵和4位的碳硫鍵同時斷裂，重排后可得到m/z為177.1 和105.3的碎片離子;1，3共軛雙鍵之間發生重排反應后，4位的碳正離子不穩定，碳氮鍵和5位的碳硫鍵繼續斷裂，重排后可得到m/z為87.2和194.1的離子碎片，這一步碎裂方式與文獻[15]結果一致。

2.3 螢火蟲樣品中熒光素的定性檢測

選取熒光素6個主要子離子碎片，組成6對MRM特征離子對，同時監測這6個反應，即m/z 281.1→235.2、194.2、177.2、105.3、87.2、203.0。若樣品中目標化合物在每級反應監測過程中出峰并且保留時間相同，便可以確認其存在。6對特征離子對幾乎全部蓋了D-蟲熒光素的所有碎裂途徑，定性結果準確可靠。圖3為D-蟲熒光素鉀鹽標準品和雌螢火蟲中6對特征離子對的檢測結果，試驗結果證實螢火蟲所含的熒光素結構為D-蟲熒光素。

2.4 方法的靈敏度和特異性

將熒光素鉀鹽稀釋成1 mg/mL的母液，用超純水逐步稀釋成濃度為125.0、62.5、31.3、12.5、6.25 μg/L系列梯度的標準溶液。在“1.2.2”儀器條件下進行上機分析。在MRM模式下選擇信號最靈敏的m/z 281.1→235.2為定量離子對，以標準溶液的濃度為橫坐標x、相應的熒光素峰面積為縱坐標y，得到標準曲線方程為y=3 630x+4 870（r=0.996 9），表明目標化合物在0.625～125.000 μg/L線性關系良好。在當前試驗條件下，方法的定量限為0.625 μg/L（S/N=10），檢出限為0.250 μg/L（S/N=5）。

只用單一離子對掃描檢測目標成分時，有時會同時出現幾個色譜峰，如圖3中m/z 281.1→87.2 和m/z 281.1→105.3 這2個離子對，在標樣和樣品中均出現幾個峰，此時就很難確定目標成分峰。當檢測指標增加至6個離子對時，目標成分就非常好辨認。在每個MRM離子對譜圖（圖3）中，同一保留時間均出現的色譜峰只有一個，即是目標成分。

2.5 實際樣品檢測

分別精確稱取穹宇螢的雌、雄、幼尾部組織，按照“1.2.1”方法處理后，在“1.2.2”儀器條件下上機測試，由外標標準曲線定量得到每100 g雌蟲、雄蟲和幼蟲的熒光素含量分別為362.69、725.00、13.76 μg。

3 結論

該研究建立的螢火蟲熒光素液相色譜-串聯質譜測定方法，有效避免了液相色譜法、分光光度法中基質的干擾，具有快速、靈敏、選擇性高等特點。該方法不僅可以用于螢火蟲發光機理、發光強弱、發光顏色差異等方面的研究，也可用于蟲熒光素人工合成及其他研究中熒光素的定量分析。

參考文獻

[1]LOWER S E，STANGERHALL K F，HAL D W.Molecular variation across populations of a widespread North American firefly， Photinus pyrails，reveals that coding changes do not underlie flash color variation or associated visual sensitivity[J].? BMC Evolutionary Biology，2018，18：1-14.

[2]YIU V，JENG M L.Oculogryphus chenghoiyanae sp.n.（Coleoptera，Lampyridae）：A new ototretine firefly from Hong Kong with descriptions of its biolu minescent behavior and ultraviolet-induced fluorescence in frmales[J].Zookeys，2018，739：65-78.

[3]EBRAHIMI M，HOSSEINKHANI S，HEYDARI A，et al.Improvement of thermostability and activity of firefly luciferase through[TMG][Ac]ionic liquid mediator[J]. Applied biochemistry biotechnology，2012，168（3）：604-615 .

[4]LESKINEN P，VIRTA M，KARP M.One-step measurement of firefly luciferase activity in yeast[J].?? Yeast，2003， 20（13）： 1109-1113.

[5]MAGHAMI P，RANJBAR B，HOSSEINKHANI S，et al.Relationship between stability and biolu minescence color of firefly luciferase[J]. Photochemical & photobiological sciences，2010， 9（3）：376-383.

[6]HIRANO T.Molecular origin of color variation in firefly（beetlle） biolu minescence：A chemical basis for biological imaging[J]. Current topics in medicinal chemistry， 2016，16（24）：2638-2647.

[7]KIYAMA M，SAITO R，IWANO S，et al.Muticolor bioluminescence obtained using firefly luciferin[J]. Current topics in medicine chemistry，? 2016，16（24）：2648-2655.

[8]NIWA? K，NAKAMURA? M，MAKI S，et al.Biosynthesis of firefly D-luciferin[J].Luminscence， 2006，21（5）：286.

[9]OBA Y，YOSHIDA N，KANIE S，et al.Biosynthesis of firefly luciferin in adult lantern：Decarboxylation of L-cysteine is a key step for benzothiazole ring formation in firefly luciferin synthesis[J].? PLoS One，2013，8（12）：1-15.

[10]NIWA K，NAKAMUA M，OHMIYA Y.Stereoisomeric bio-inversion key to biosynthesis of firefly D-luciferin[J]. FEBS Letters，2006， 580（22）：5283-5287.

[11]何雄，周靜峰，孫金才.銀納米粒子基底制備及表面增強拉曼光譜法檢測熒光素鈉[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（5）：1084-1088.

[12]李伯平，郭冬發.分光光度法測定鉆井液中示蹤劑熒光素鈉[J].中國無機分析化學，2013， 3（1）：38-40.

[13]蔣俊，王祖翔，任連兵，等.HPLC 法同時測定果汁飲料中曙紅、熒光桃紅、熒光素鈉[J].分析實驗室，2011，30（12）：34-37.

[14]奚星林，邵仕萍，徐娟，等.固相萃取-高效液相色譜法同時測定食品中的12種合成色素[J].中國食品衛生雜志，2012，24（3）：217-222.

[15]KANIE S，NAKAI R，OJIKA M，et al.2-S-cysteinylhydroquinone is an intermediate for the firefly lusiferin biosynthesis that occurs in the pupal stage of the Japanese firefly，Luciola lateralis[J].Bioorganic chemistry，2018，80：223-229.