LC-MS/MS法測定火鍋食品中5種罌粟殼生物堿的不確定度評定

衛星華 李小紅 董曼曼 孫 曉 張荻悅 張亞鋒

(西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054)

罌粟殼是植物罌粟的干燥成熟果殼，其含有多種生物堿類物質，加入食品中會使人覺得更加美味，然而長期食用添加了罌粟殼的食品，會使人成癮，給身體造成一定的損害，甚至導致死亡[1]。目前罌粟殼已被衛生部列入食品中可能違法添加的非食用物質名單中，禁止添加于火鍋底料及小吃類食品中，并針對其含有的5種主要生物堿成分制定了相關的檢驗標準[2]。

在測量及評定過程中往往存在各種各樣的影響因素[3-5]，不但影響測評結果，也影響與之相關的司法裁決、行政決定、仲裁結果等評判的正確性[6]。研究參照相關標準[7-9]，通過建立數學模型，對火鍋食品中5種罌粟殼生物堿含量的不確定度來源進行討論，以期為該檢測方法及結果的準確度提供數據支持，并為實驗室質量控制及其他非法添加的檢測提供不確定度評定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火鍋底料：市售抽檢樣品；

乙腈：色譜純，德國Merck公司；

甲酸、甲酸銨、無水硫酸鎂、無水醋酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

試驗用水為超純水；

嗎啡標準品：99.8%，中國藥品生物制品檢定所；

鹽酸罌粟堿標準品：99.9%，德國Sigma-Aldrich公司；

蒂巴因標準品：100%，中國藥品生物制品檢定所；

可待因標準品(液標)：99.88%，德國Sigma-Aldrich公司；

那可丁標準品：100%，中國藥品生物制品檢定所；

嗎啡-D3標準品、可待因-D3標準品(液標)：100%，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

液相色譜—質譜聯用儀：Agilent 1200型液相色譜儀，Agilent 6410B Triple Quad LC/MS型三重串聯四極桿質譜儀，配ESI離子源及MassHunter數據處理軟件，美國Agilent公司；

電子分析天平：ME204E及MS105型，美國Mettler Toledo集團公司；

純化水機：Milli-Q型，密理博中國有限公司；

超聲波清洗器：KQ-700VDB型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制 分別準確稱取標準品適量，用含0.5%甲酸的甲醇溶液配成罌粟堿、那可丁、蒂巴因和嗎啡含量均為1 mg/mL的標準儲備溶液。嗎啡-D3、可待因-D3 和可待因均為液標，直接作為標準儲備液使用。分別準確吸取粟堿、那可丁、蒂巴因標準儲備液各1 mL，嗎啡、可待因標準儲備液各5 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，混勻，即得含罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為40 μg/mL和嗎啡、可待因濃度為200 μg/mL的混合標準品溶液。

吸取上述混合標準品溶液5，2，1 mL，內標標準儲備液0.2 mL，用乙腈分別定容至10 mL容量瓶中。另吸取上述混合標準品溶液1 mL，用乙腈定容至10 mL容量瓶中，作為中間標準品溶液，吸取中間標準品溶液0.1，0.2，0.3，0.5 mL，內標標準儲備液0.2 mL，用乙腈分別定容至10 mL容量瓶中。得到罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為0.4，0.8，1.2，2，4，8，20 ng/mL，嗎啡、可待因濃度為2，4，6，10，20，40，100 ng/mL的系列標準工作溶液，內標溶液濃度均為40 ng/mL。

1.3.2 樣品處理方法 稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入0.3 mL內標標準儲備液，加入5 mL水。渦旋30 s，準確加入15 mL乙腈，渦旋1 min，超聲30 min，加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉，立即渦旋2 min，以6 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜作為待測樣品。

1.3.3 色譜條件 流動相：A相為乙腈，B相為含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液，按0.0～0.3 min，90% A；0.3～1.0 min，90%～75% A；1.0～3.5 min，75% A；3.5～4.0 min，75%～90% A；4.0～7.0 min，90% A進行梯度洗脫。色譜柱：Shiseido Capcell Pak C18MGⅢ，2.0 mm×150 mm，5 μm；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL；離子化方式：電噴霧電離； 掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；5種目標化合物的質譜條件詳見表1。

1.4 數據處理

將系列標準工作溶液及經處理后的樣品進樣，罌粟堿、那可丁和蒂巴因采用外標法定量，嗎啡和可待因為內標法定量，繪制標準工作曲線，將所得樣品數據帶入曲線，計算得到樣品中5種物質的含量。

表1 5種目標化合物及2種內標的質譜條件?Table 1 Mass spectrometry conditions of 5 target compounds and 2 internal standards

? *為定量離子。

2 結果與分析

2.1 建立數學模型

根據模型建立原理及檢測過程，計算火鍋食品中5種罌粟殼生物堿的含量，罌粟堿、那可丁、蒂巴因采用外標法定量，可待因和嗎啡采用內標法定量，樣品含量按式(1) 計算。

式中：

X——試樣中5種生物堿的含量，μg/kg；

c——試樣溶液中5種生物堿的濃度，μg/L；

V——定容體積，mL；

m——樣品質量，g；

r——回收率，%。

2.2 來源分析

由2.1中模型可知，測定不確定度主要來自以下幾個方面：① 標準系列溶液配制過程所引入的不確定度，主要為標準物質稱量urel(m標)及量具使用urel(V標)引入的不確定度；② 繪制標準工作曲線引入的不確定度urel(C標曲)；③ 樣品前處理過程引入的不確定度，主要為樣品稱量urel(m樣)及樣品提取urel(V樣)引入的不確定度；④ 樣品的重復性引入的不確定度urel(f)；⑤ 由液質聯用儀使用引入的不確定度urel(f液質)；⑥ 回收率引入的不確定度urel(r)。其中各不確定度分量相互獨立，被測樣品的相對標準不確定度合成公式為：

(2)

2.3 各不確定度分量的分析與計算

2.3.1 標準系列溶液配制過程所引入的不確定度

(1) 標準物質稱量引入的不確定度：采用十萬分之一天平，根據檢定證書，影響其不確定度的主因素及相關分量的標準不確定度計算結果如表2所示。由于標準物質證書未給出其誤差范圍，故在計算中可忽略。

表2 天平(d=0.01 mg)稱量引入的不確定度Table 2 Standard uncertainty of balance (d=0.01 mg) measurement

其合成標準不確定度為：

u(m天平)=

6.78×10-5g。

采用減重法分兩步稱取標準品，以嗎啡為例，2次稱取數值分別為42.43，31.80 mg，以均勻分布計算，則嗎啡的相對不確定度為：

urel(m嗎啡)=[(6.78×10-5)/(42.43×10-3)]2+[(6.78×10-5)/(31.80×10-3)]2=2.66×10-3。

標準物質稱量引入的相對不確定度計算結果見表3，可待因為液標無稱量過程，故無標準物質稱量引入的相對不確定度。

表3 標準物質稱量引入的相對不確定度計算結果Table 3 Standard uncertainty of material weighing

(2) 量具使用引入的不確定度：量具的使用及溫度是影響其不確定度分量的主要因素，由3部分組成：容量允差u(V1)、估讀誤差u(V2)及使用與配制時的溫度u(V3)影響。

實驗室溫度為20 ℃(在±5 ℃之間變動)，按照均勻分布，查得20 ℃的膨脹系數(α)，甲醇為1.2×10-3，甲酸為1.03×10-3，乙腈為1.37×10-3，玻璃為2.5×10-4。由于含0.5%甲酸的甲醇溶液中甲酸含量較小，可忽略不計。玻璃量具的體膨脹系數明顯小于液體的膨脹系數，可忽略不計。根據JJG196—2006《常用玻璃量器檢定規程》規定內容，所用量具均為A級，歐洲分析化學中心(EURACHEM)認為其服從三角分布，計算各分量的標準不確定度，以A類1 mL單標線吸量管為例進行計算：

嗎啡、可待因配置過程中1 mL單標線吸量管使用次數為4次(一根吸量管多次使用)，其相對標準不確定度分別為：

8.88×10-3。

罌粟堿、蒂巴因、那可丁使用次數為5次，其相對標準不確定度分別為：

9.96×10-3。

根據表4中不同量具的相對標準不確定度及1.3.1中標準溶液配制過程，計算配置標準系列溶液引入的相對合成標準不確定度見表5。

2.3.2 擬合標準工作曲線產生的不確定度 對標曲7個不同濃度的點分別測定1次，得到相應的色譜峰面積A，擬合線性回歸方程為A=aC+b(a，b分別為斜率和截距)，測定數據及計算結果如表6所示。嗎啡、可待因采用內標法，嗎啡-D3濃度為76.68 ng/mL，峰面積為2 283，2 308，1 949，2 288，2 186，2 048，2 286；可待因-D3濃度為79.92 ng/mL，峰面積為1 416，1 538，1 329，1 519，1 501，1 453，1 445。取一陽性樣品進行6次重復測量，樣品中5種生物堿的平均濃度分別為罌粟堿4.331 1 ng/mL、那可丁3.899 1 ng/mL、蒂巴因3.023 3 ng/mL、嗎啡26.022 1 ng/mL、可待因23.020 1 ng/mL，由最小二乘法擬合校準曲線引入的標準不確定度如式(3)所示。

表4 量具使用引入的不確定度?Table 4 Standard uncertainty of measuring tool usage

? a為嗎啡；b為罌粟堿、蒂巴因、那可丁；c為可待因。

表5 配置標準系列溶液引入的相對合成標準不確定度Table 5 Standard uncertainty of standard series solution configured

(3)

式中：

a——曲線的斜率；

b——曲線的截距；

x——樣品的平均濃度，ng/mL；

C——標準工作溶液濃度的平均值，ng/mL；

n——標曲的測定次數，n=7；

P——樣品的測定次數，P=6；

i——不同濃度標準工作溶液的下角標。

擬合標準工作曲線進行樣品測量所產生的相對標準不確定度見表7。

2.3.3 樣品前處理及測量引入的不確定度

(1) 樣品稱量引入的不確定度：采用萬分之一天平，其影響因素及計算與“2.3.1(1)”中有關過程相同。根據檢定證書，各分量的標準不確定度如表8所示。

平行稱取2份樣品，稱樣量分別為2.027 2，2.003 8 g，則樣品稱量引入的相對不確定度為：

表6 標準曲線相關數據Table 6 Standard curve data

表7 配置標準系列溶液引入的相對合成標準不確定度Table 7 Standard uncertainty of standard series solution configured

表8 天平(d=0.1 mg)稱量引入的不確定度Table 8 Standard uncertainty for balance (d=0.1 mg) measurement

使用量具定容過程引入的相對標準不確定度為：

urel(V樣)=

2.003 8=2.64×10-2。

2.3.4 樣品重復性引入的不確定度 樣品重復性引入的不確定度包含了c、V和m測量時的重復性不確定度的分量，屬A類評定。對樣品進行6次測定的值及其平均值及應用貝塞爾公式計算單次測量結果的試驗標準偏差(n=6)結果見表9。

樣品重復性引入的相對不確定度為：

urel(f罌粟堿)=6.22×10-2/4.340 2=1.43×10-2；

urel(f那可丁)=8.26×10-2/3.906 2=2.11×10-2；

urel(f蒂巴因)=6.75×10-2/3.023 6=2.23×10-2；

urel(f嗎啡)=1.88/26.023 2=7.22×10-2；

urel(f可待因)=1.77/23.015 7=7.69×10-2。

2.3.5 由液質聯用儀使用引入的不確定度 由校準證書上可知，Agilent 1200-6410液質聯用儀的峰面積重復性為0.7%，則其相對擴展不確定度為0.7%，按均勻分布計算，其相對標準不確定度為：

2.3.6 樣品回收率引入的不確定度 對上述樣品進行6次加標回收試驗，將混合標準品溶液加入空白樣品中，照1.3.2方法處理，即得加標回收樣品，并對加標樣品進行測定，樣品添加水平及所得回收率如表10所示。

用貝塞爾公式計算回收率的標準偏差，樣品回收率引入的相對標準不確定度為：

表9 樣品數據Table 9 Analytical results of sample

表10 樣品回收率Table 10 The recovery rate of sample (n=6)

采用t檢驗對平均回收率進行顯著性檢驗。

5種成分的t值與95%置信度，n—1自由度的雙邊臨界值比較，結果均大于2.571，說明r與100%有非常顯著差異，必須在計算公式中采用回收率校正因子r修正結果。

2.3.7 罌粟殼中5種生物堿的合成標準不確定度及擴展不確定度 各不確定分量相互獨立，按式(2)計算可得相對合成標準不確定度如表11所示。

由模型和2次獨立樣品的試驗結果，計算得到2份火鍋食品中5種物質的含量分別為罌粟堿31.1 μg/kg、嗎啡179.0 μg/kg、那可丁28.5 μg/kg、蒂巴因22.2 μg/kg、可待因171.0 μg/kg，合成標準不確定度為：

表11 5種生物堿的相對合成標準不確定度Table 11 Standard uncertainty of 5 alkaloids

取包含因子k=2，包含概率95%，計算擴展不確定度可得：

U罌粟堿=k×U罌粟堿(X)=2×1.2=2.4 μg/kg。

同法可得：

U嗎啡=22 μg/kg，U那可丁=2.0 μg/kg，U蒂巴因=1.9 μg/kg，U可待因=22 μg/kg。

因此，液質聯用法測定火鍋食品中5種生物堿測量結果可表示為：罌粟堿(31.1±2.4) μg/kg，k=2；嗎啡(179±22) μg/kg，k=2；那可丁(28.5±2.0) μg/kg，k=2；蒂巴因(22.2±1.9) μg/kg，k=2；可待因(171±22) μg/kg，k=2。

3 結論

試驗評定了液質聯用法測定火鍋食品中5種罌粟殼生物堿含量的不確定度，根據各分量不確定度的計算結果可以得出，影響檢測結果不確定度的主要因素有樣品回收率，樣品平行試驗重復性，樣品提取，校準曲線擬合，標準工作溶液的配制。從校準曲線擬合這一不確定度分量可以看出，采用內標法進行測定的嗎啡和可待因相對標準不確定度明顯小于其他3種物質。在試驗中，建議通過以下幾個方面來降低檢測結果的不確定度：① 減少量具使用次數并規范估讀量具讀數至最小分度值的1/5～1/10，可以降低量具引入的測量不確定度；② 對需檢測成分加入內標定量，可以降低不同樣品基質所引入的不確定度；③ 被測樣品濃度均值應接近所配制的罌粟堿等5種物質工作曲線的中間位置，以降低標準曲線變動引入的測量不確定度；④ 提高人員操作熟練程度，可以適當降低樣品重復性所引入的不確定度；⑤ 試驗前提前穩定儀器狀態并定期對所涉儀器進行檢定，使儀器保持較高的靈敏度及穩定性，可以降低儀器引入的不確定度。