大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子單克隆抗體的制備與鑒定

王 耀 李燕虹 曹金博 孫亞寧 邢云瑞 陳秀金 鄧瑞廣 胡驍飛

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002)

大豆含有豐富的蛋白質(zhì)和油脂資源，是重要的食品和飼料加工原料，但其也含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子和致敏蛋白[1]，這些物質(zhì)可能誘發(fā)過敏反應(yīng)，降低大豆?fàn)I養(yǎng)價值，影響大豆利用效率[2]。大豆胰蛋白酶抑制因子(Soybean trypisin inhibitor，STI)是其中重要的一種，主要包括Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Kunitz trypsin inhibitor，KTI)和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(Bowman-Birk trypsin inhibitor，BBI)兩種類型，分別約占大豆蛋白總量的1.4%，0.6%[3]。STI雖已被證明具有抗癌和抗炎生物活性[4]，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值[5]，但其也可抑制機體胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性，導(dǎo)致消化不良，阻礙生長發(fā)育[6]。因此建立特異、高效的檢測方法來監(jiān)測大豆及其制品中STI的含量顯得尤為重要。

目前，胰蛋白酶抑制因子多采用脲酶檢測法、酶化學(xué)分析法進行檢測，但是這些檢測方法的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性較差[7]。近年來，利用特異性抗體建立起來的酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)能夠準(zhǔn)確、靈敏地檢測STI含量，已成為STI快速檢測方法研究的主要趨勢[8]。張國龍等[9]利用兔源多克隆抗體建立了可用于大豆和大豆產(chǎn)品中KTI定量檢測的直接競爭ELISA方法；邢春芳等[10]也利用兔源多克隆抗體建立了STI的間接競爭ELISA檢測方法，能夠代替酶化學(xué)分析法用于豆粕及豆制品中胰蛋白酶抑制因子的檢測。而單克隆抗體(Monoclonal antibody，mAb)相對于多克隆抗體具有均一性和特異性強等優(yōu)勢，更有利于建立靈敏、特異的ELISA方法。目前已有相關(guān)研究[11-12]利用mAb建立了用于KTI定量分析的ELISA檢測方法，但缺乏對抗體免疫學(xué)特性的鑒定與描述。試驗擬通過動物免疫和細(xì)胞融合，篩選穩(wěn)定分泌KTI mAb的雜交瘤細(xì)胞株，并對所制備抗體的效價、亞型、敏感性、親和力、特異性等免疫學(xué)特性進行鑒定，旨在為建立KTI的ELISA檢測方法及其他免疫學(xué)檢測方法提供可靠的抗體保障，為大豆及其制品中KTI的高效監(jiān)測提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑溶液

弗氏佐劑(Freund’s complete/incomplete adjuvant，F(xiàn)CA/FIA)，KTI、BBI、大豆凝集素(Soybean agglutinin，SBA)、大豆球蛋白(Glycinin)、β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)等標(biāo)準(zhǔn)品，鼠源mAb分型試劑：美國Sigma-Aldrich公司；

胎牛血清、選擇性培養(yǎng)基(HAT、HT)、不完全培養(yǎng)基(RPMI-1640)等細(xì)胞培養(yǎng)試劑，SDS-PAGE蛋白Marker，酶標(biāo)羊抗鼠IgG抗體(GaMIgG-HRP)，NC膜等試驗材料：索萊寶生物科技公司；

ELISA所用包被液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，CBS)、稀釋液(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，PBS)、封閉液(含5%脫脂奶的PBST溶液)、顯色液(TMB磷酸—檸檬酸緩沖液)、終止液包被液(2 mol/L H2SO4溶液)等溶液：實驗室配置；

其他試劑均為市售分析級試劑。

1.2 主要儀器

電子天平：ME204E型，德國Mettler Toledo公司；

CO2培養(yǎng)箱：INCO153型，德國Memmert公司；

倒置生物顯微鏡：DMI3000型，德國Leica公司；

生物潔凈工作臺：BCM-1000A型，蘇凈安泰有限公司；

酶標(biāo)儀：iMark450/550型，美國Bio-Rad公司；

蛋白凝膠電泳系統(tǒng)：Mini-PROTEAN型，美國Bio-Rad公司；

轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)：Trans-Blot型，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗動物及骨髓瘤細(xì)胞

免疫動物為6～8周齡無特定病原體(SPF)級雌性BALB/c小鼠，液體石蠟預(yù)處理的SPF級BALB/c小鼠用于腹水制備。骨髓瘤細(xì)胞為小鼠NS0骨髓瘤細(xì)胞。

1.4 小鼠免疫及多抗血清鑒定

首次免疫，將KTI與等量FCA混合，取3只小鼠以50 μg/(200 μL·只)的劑量背部皮下多點注射。此后每隔3周加強免疫1次，免疫劑量和方式與首次免疫相同。共進行4次免疫，免疫結(jié)束3周后，對小鼠斷尾采血，獲得多抗血清。

多抗血清效價采用間接ELISA進行測定[13]，首先在已包被抗原的酶標(biāo)板中加入倍比稀釋的抗體，37 ℃孵育15 min，洗板后加入GaMIgG-HRP，37 ℃孵育30 min，洗板后加入顯色液，10 min后終止顯色并讀取OD450 nm值，以測定OD450 nm的P/N值≥2.1判定多抗血清效價(P為陽性孔OD450 nm值，N為陰性孔OD450 nm值)。

多抗血清敏感性采用間接競爭ELISA進行鑒定[13]，首先向酶標(biāo)板中加入效價測定中OD450 nm值為1.0左右的血清稀釋液和具有梯度抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液(作為酶標(biāo)板上已包被抗原的競爭物)，余下步驟按上述效價測定步驟進行。待酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值之后，求出抑制率B/B0，其中B0為抗原濃度為0時的OD450 nm值，B為抗原不同標(biāo)準(zhǔn)濃度所對應(yīng)的OD450 nm值。然后將抗原濃度對數(shù)值和抑制率分別作為橫、縱坐標(biāo)繪制抑制曲線，根據(jù)曲線線性回歸方程計算半數(shù)抑制濃度IC50衡量多抗血清敏感性。

1.5 細(xì)胞融合與篩選

復(fù)蘇NS0瘤細(xì)胞，選取生長狀態(tài)良好的瘤細(xì)胞進行擴大培養(yǎng)準(zhǔn)備融合。取多抗血清效價高、敏感性好的小鼠進行腹腔注射超免，劑量仍為50 μg/(200 μL·只)，但不加佐劑，超免3 d后，取小鼠脾臟分離脾細(xì)胞與NS0細(xì)胞進行融合[14]34，將細(xì)胞懸液鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板并進行培養(yǎng)，7 d后用HT培養(yǎng)基半量換液，并密切觀察細(xì)胞生長情況，10 d左右抽取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，同樣采用間接ELISA和間接競爭ELISA進行篩選，挑選效價高、敏感性好、生長旺盛的細(xì)胞采用有限稀釋法進行亞克隆[15]，反復(fù)篩選直至建立穩(wěn)定分泌KTI mAb的陽性雜交瘤細(xì)胞株。

1.6 KTI mAb的大量制備及免疫學(xué)特性鑒定

擴大培養(yǎng)已篩選的陽性雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤細(xì)胞(約106個)腹腔注射經(jīng)液體石蠟預(yù)處理的BLAB/c小鼠。待小鼠腹部明顯腫脹時便可用無菌注射器采集腹水，將腹水以5 000 r/min離心10 min，取上清液采用飽和硫酸銨鹽析法純化[14]22，并用PBS透析3 d得到KTI mAb。

抗體免疫學(xué)特性鑒定包括效價、亞型、親和常數(shù)、敏感性和特異性5個方面。效價和敏感性鑒定方法同1.3中多抗血清效價測定和敏感性的鑒定。

亞型通過鼠源mAb分型試劑進行鑒定，利用間接ELISA原理將mAb稀釋包被酶標(biāo)板，然后加入IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM分型試劑，最終根據(jù)OD450 nm值判斷mAb亞型。

親和常數(shù)(Affinity constant，Ka)根據(jù)飽和ELISA法[16]，在不同濃度抗原包被情況下，測定抗體半飽和濃度，按式(1)計算。

Ka=(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)，

(1)

式中：

Ka——親和常數(shù)，L/mol；

n——不同包被濃度的比值；

[Ab]t、[Ab’]t——不同包被濃度下抗體半飽和濃度，mol/L。

特異性通過測定交叉反應(yīng)率和免疫印跡試驗進行鑒定，交叉反應(yīng)率通過間接競爭ELISA測定大豆中其他抗?fàn)I養(yǎng)因子和致敏蛋白競爭物(大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、SBA、BBI)的IC50進行計算(交叉反應(yīng)率CR=KTI的IC50/其他競爭物的IC50)[17]；免疫印跡試驗首先將上述交叉反應(yīng)競爭物與KTI以同一濃度進行SDS-PAGE，試驗時在同一凝膠上做一重復(fù)，一半用于考馬斯亮藍(lán)染色并脫色觀察，另一半進行轉(zhuǎn)膜后，加入抗體37 ℃條件下孵育2 h，經(jīng)過PBST洗滌，再與GaMIgG-HRP孵育2 h，經(jīng)PBST洗滌后ECL熒光顯色液顯色，將顯色結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果進行對照，判斷KTI mAb的特異性[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠多抗血清的鑒定

間接ELISA方法測定多抗血清的效價結(jié)果(見表1)表明，3只小鼠免疫效果良好，效價均能達到1∶12 800以上，其中1號小鼠免疫效果最為顯著。

表1 多抗血清效價的間接ELISA測定結(jié)果Table 1 Titer of mouse antiserum detected by indirect ELISA (OD450 mm)

通過間接競爭ELISA鑒定各小鼠多抗血清的敏感性，其中1號小鼠多抗血清敏感性最好，間接競爭ELISA抑制曲線如圖1所示，KTI對1號小鼠多抗血清產(chǎn)生了明顯的抑制效果，將抑制率B/B0作為縱坐標(biāo)，KTI濃度對數(shù)值作為橫坐標(biāo)繪制抑制曲線，得到線性方程，計算抑制率B/B0為0.5時的多抗血清的IC50為157.33 ng/mL。

圖1 KTI對多抗血清的抑制曲線Figure 1 Inhibitive curve for antiserum to KTI

2.2 KTI mAb的制備

根據(jù)免疫小鼠多抗血清效價及敏感性鑒定結(jié)果選擇1號小鼠進行細(xì)胞融合，初次篩選96孔細(xì)胞板中強陽性細(xì)胞株，然后轉(zhuǎn)入24孔細(xì)胞板中擴大培養(yǎng)后復(fù)篩，挑選強陽性細(xì)胞株，將陽性細(xì)胞株進行亞克隆，最終篩選到1株效價高、敏感性好的雜交瘤細(xì)胞，命名為4E6-E9，經(jīng)過多次凍存與復(fù)蘇后，仍能夠穩(wěn)定分泌抗體。通過小鼠體內(nèi)誘生腹水法得到4E6-E9腹水，純化后用于鑒定抗體的免疫學(xué)特性。

2.3 KTI mAb效價的測定

通過間接ELISA測定4E6-E9 mAb的效價結(jié)果如表2 所示，3次平行重復(fù)測定4E6-E9 mAb效價OD450 nm值較為穩(wěn)定，效價能夠達到1∶1 638 400，相對于小鼠多抗血清有顯著提高，且高于張國龍等[9]制備的兔源多抗血清效價(1∶128 000)。

表2 4E6-E9 mAb效價測定Table 2 Determination of the titer of 4E6-E9 mAb (OD450 nm)

2.4 KTI mAb亞型的鑒定

采用mAb分型試劑通過間接ELISA方法對4E6-E9 mAb亞型進行鑒定，結(jié)果如圖2所示，根據(jù)分型試劑與4E6-E9 mAb結(jié)合的OD450 nm值判斷獲得抗體亞型，結(jié)果IgG1分型試劑對應(yīng)的OD450 nm值最高，且其他分型試劑對應(yīng)的OD450 nm值均較小，說明所制備的4E6-E9 mAb亞型為IgG1型。

圖2 4E6-E9 mAb亞型鑒定Figure 2 Identification of subtype of 4E6-E9 mAb

2.5 KTI mAb親和常數(shù)的測定

將KTI以5，1 μg/mL兩個濃度分別包被ELISA酶標(biāo)板，通過ELISA飽和法繪制的親和常數(shù)測定曲線如圖3 所示，5 μg/mL包被時，4E6-E9 mAb與KTI結(jié)合達到半飽和狀態(tài)的濃度為794.18 ng/mL；1 μg/mL包被時，4E6-E9 mAb與KTI結(jié)合達到半飽和狀態(tài)的濃度為600.96 ng/mL。根據(jù)公式計算可得Ka=1.45×108L/mol，通常Ka>107L/mol即為高親和力抗體[19]，因此試驗所制備的4E6-E9 mAb具有較高的親和力。

圖3 4E6-E9 mAb親和常數(shù)測定曲線Figure 3 Affinity constant measurement curve of 4E6-E9 mAb

2.6 KTI mAb敏感性的鑒定

間接競爭ELISA抑制曲線如圖4所示。由抑制曲線的線性回歸方程可以計算得到4E6-E9 mAb的IC50為28.39 ng/mL，相對于小鼠多抗血清，敏感性有了顯著提升。邢春芳等[10]制備兔源多抗血清所建立的ELISA方法的IC50為360 ng/mL，與其相比，試驗所制備的4E6-E9 mAb 具有較低的IC50，說明單抗的敏感性高于多抗敏感性，更有利于ELISA檢測方法的建立。

圖4 KTI對4E6-E9 mAb的抑制曲線Figure 4 Inhibitive curve for 4E6-E9 mAb to KTI

2.7 KTI mAb特異性的鑒定

由表3可知，4E6-E9 mAb與大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、BBI、SBA的交叉反應(yīng)率>0.3%，表明4種競爭物與4E6-E9 mAb之間基本沒有交叉反應(yīng)。

將4種競爭物與KTI進行SDS-PAGE，同一凝膠上做一重復(fù)，將所做重復(fù)進行免疫印跡試驗。4E6-E9 mAb特異性鑒定結(jié)果如圖5所示，對比結(jié)果表明4E6-E9 mAb僅與第6泳道KTI蛋白結(jié)合，表明試驗所制備的4E6-E9 mAb具有較強的特異性。

表3 4E6-E9 mAb的交叉反應(yīng)結(jié)果Table 3 The cross-reactivity of 4E6-E9 mAb

1. Marker 2. 大豆球蛋白 3. β-伴大豆球蛋白 4. SBA 5. BBI 6. KTI

3 結(jié)論

試驗在免疫BALB/c小鼠，獲得效價和敏感性良好的多抗血清基礎(chǔ)上，進行細(xì)胞融合，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，得到穩(wěn)定分泌KTI mAb的4E6-E9雜交瘤細(xì)胞株。通過體內(nèi)誘生腹水法制備4E6-E9 mAb，并對抗體免疫學(xué)特性進行充分鑒定，其效價達到1∶1 638 400，亞型為IgG1型，親和常數(shù)為1.45×108L/mol，IC50為28.39 ng/mL，且只與KTI特異性結(jié)合，與其他抗?fàn)I養(yǎng)因子和致敏蛋白結(jié)合無交叉反應(yīng)。試驗制備的KTI mAb具備良好的免疫學(xué)特性，可用于靈敏、特異的大豆及其制品中KTI免疫學(xué)檢測方法的建立，但在具體免疫學(xué)檢測方法研究中，仍需對其應(yīng)用條件和方式進行進一步探索，若將其與功能性納米材料及高通量傳感技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)新型快速檢測方法與裝備，將會為飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子以及食品中大豆致敏蛋白的高效監(jiān)測提供有力技術(shù)支撐。