恩施市泡蘿卜中乳酸菌的分離鑒定及其對品質的影響

倪 慧,王 強,魏冰倩,廖 華,張振東,郭 壯,3,*

(1.湖北文理學院食品科學技術學院,鄂西北傳統發酵食品研究所,湖北襄陽 441053; 2.恩施市農業局,湖北恩施 445000; 3.恩施市公共檢驗檢測中心,湖北恩施 445000)

泡蘿卜是以蘿卜為原料,浸漬在5%～8%的鹽水中,依靠自身攜帶的乳酸菌經6～10 d發酵而成的一類蔬菜制品,因質地脆嫩和風味獨特而深受消費者青睞[1-2]。傳統方法生產的泡蘿卜多為自然發酵,存在發酵過程中易“生花”[3]和產品質量不穩定等問題[4]。為了彌補自然發酵的不足之處,國內外研究人員嘗試從泡菜水中分離乳酸菌[5-6],并將具有優良發酵特性的乳酸菌分離株應用于泡菜的生產中。侯曉艷等[7]利用短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和植物乳桿菌(L.plantarum)進行泡蘿卜制備,發現純種發酵可以明顯地縮短發酵周期并提升產品品質。

作為湖北省唯一的少數民族自治州,恩施土家族苗族自治州境內海拔落差大、小氣候特征明顯且生物多樣性較高,因而有華中地區“動植物基因庫”之稱。恩施土家族苗族自治州恩施市居民歷來就有使用蘿卜、豇豆和辣椒等蔬菜制作泡菜的習俗,由于地理環境的特殊性,該地制作的泡菜中可能蘊含著豐富的乳酸菌資源,然而目前關于恩施市泡菜中乳酸菌多樣性研究的報道尚少。

本研究以恩施市泡蘿卜為研究對象,對樣品中蘊含的乳酸菌資源進行了分離鑒定,同時采用色度儀、質構儀和電子鼻等設備,對其分離株純種發酵制備泡蘿卜的品質進行了評價,以期為后續泡蘿卜用乳酸菌發酵劑的開發提供菌種支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡蘿卜 采集自恩施市菜市場;MRS培養基 青島海博生物技術有限公司;飽和酚、氯仿、溴化十六烷基三甲基銨(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)、乙二胺四乙酸、異戊醇、乙醇、三羥甲基氨基甲烷、醋酸鈉、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉和碳酸鈣 國藥集團化學試劑有限公司;Axygen PCR 清潔試劑盒 康寧生命科學吳江有限公司;引物27F/1495R 由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成;DL15000 Maker、DL2000 Maker、10×PCR buffer、dNTP mix、r Taq酶、pMD18-T克隆載體 寶生物工程(大連)有限公司。

HBM-400B拍擊式無菌均質器 天津市恒奧科技發展有限公司;DWS DG250厭氧工作站 英國Don Whitley公司;DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠;R40-IIB2生物安全柜 中國青島海爾;5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;PTC-100PCR儀 美國Bio-Rad公司;FluorChem FC3化學發光凝膠成像系統 美國ProteinSimple公司;3-18k離心機 德國SIGMA實驗室離心機股份有限公司;UltraScan PRO色度儀 美國HunterLab公司;TA.XT plus質構儀 英國SMS公司;PEN3電子鼻 德國Airsense公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集 2017年11月于恩施州土家族苗族自治州恩施市舞陽壩菜市場和六角菜市場(109.47°N,30.3°E)采集泡蘿卜樣品5份,樣品在采集過程中應符合以下條件:樣品未經過熱處理;樣品無異味、無霉變;制作泡蘿卜的品種為白蘿卜且產地在恩施市;泡蘿卜的加工地亦在恩施市[8]。從每個采樣點采集泡蘿卜樣品約500 g裝入采樣袋中并置于含有冰袋的采樣箱中迅速帶回實驗室。

1.2.2 乳酸菌的分離 使用滅菌刀和砧板將樣品切碎后,加入適量生理鹽水后裝入無菌厭氧袋中,并使用拍擊器拍擊3 min。采用倍比稀釋法對拍擊好的樣品進行稀釋,取10-2、10-3、10-4和10-5四個梯度稀釋液涂布于含有1.0%碳酸鈣的MRS固體培養基上,于DG250厭氧工作站中37 ℃培養48 h,工作站中通入含有氮氣、氫氣和二氧化碳的混合氣體,其體積比為85∶10∶5[9]。選擇菌落數在30～300間的平皿,按照菌落大小、顏色和是否有透明圈等特點挑取單菌落,劃線純化3次后進行過氧化氫酶實驗,同時進行革蘭氏染色并對菌株形態進行觀察,將過氧化氫酶實驗為陰性而革蘭氏染色為陽性的菌株定義為潛在乳酸菌菌株[10]。

1.2.3 乳酸菌的鑒定 使用CTAB法進行潛在乳酸菌菌株基因組DNA的提取[11],并以它為模板進行PCR擴增,PCR擴增靶點為16S rRNA,PCR擴增引物為27F/1495R,其中正向引物序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物序列為5′-CTACGGCTACCTTCTTACGA-3′。PCR擴增體系(25 μL)為:正反引物(10 μmol/μL)各0.5 μL,模板DNA 0.5 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP mix 2 μL,r Taq酶0.3 μL,加超純水至25 μL。PCR擴增程序為:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,30次循環;72 ℃延伸10 min,4 ℃保溫[12]。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對基因組DNA和PCR擴增產物分別進行濃度和純度的定性檢測,檢測合格后的PCR產物使用Axygen PCR清潔試劑盒進行清洗,清潔產物進一步連接轉化后挑取陽性克隆子送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。測序公司反饋回的序列在NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)采用BLAST方法與模式菌株進行比對進而明確其種屬分類地位[13]。

1.2.4 乳酸菌菌株純種發酵泡蘿卜的制備 將乳酸菌分離株接入MRS液體培養基中,37 ℃培養24 h后,再次轉接入新鮮MRS液體培養基中活化兩代,10000 r/min離心5 min棄上清,加入10 mL生理鹽水吹打均勻備用,白蘿卜切成1 cm×1 cm×5 cm條狀備用。取白蘿卜350 g、食鹽39.5 g和煮沸冷卻的水600 mL裝入1 L藍蓋瓶,按照1.5×107CFU/g白蘿卜的比例接入菌懸液,25 ℃發酵7 d。設置不接乳酸菌自然發酵的泡蘿卜為對照組,對照組除不接入乳酸菌外,其制作工藝和配料比與乳酸菌純種發酵組均相同。

1.2.5 泡菜水色度的測定 將發酵結束后的泡菜水10000 r/min離心5 min取上清備用。使用光阱和白板對色度儀校正后,將泡菜水裝入50 mm×10 mm的石英比色皿中,采用透射模式對樣品的L*(亮度)、a*(紅綠度)和b*(黃藍度)進行測定,每個樣品平行測定3次[14]。

1.2.6 泡菜質構的測定 采用穿刺模式對泡蘿卜的咀嚼性、脆性和硬度進行測定,其中測試模式為穿刺模式,探頭為P/2柱形探頭(直徑為2 mm),測試前速率為1 mm/s,測試速率為5 mm/s,測試后速率為5 mm/s,壓縮比為50%,最小感知力5 g[15]。每個樣品取5個泡蘿卜條,每個蘿卜條取3個測試點。

1.2.7 基于電子鼻技術泡菜風味品質的評價 取15 mL泡菜水于電子鼻樣品瓶中,55 ℃保溫10 min且室溫平衡10 min后,使用電子鼻進行測定,傳感器清洗時間為90 s,插入時間為5 s,測試時間為60 s,進樣流量為120 mL/min,內部流量為120 mL/min[16]。每個樣品平行測定3次,取49、50、51 s數據求平均值。

1.3 統計分析

采用主成分分析法(principal component analysis,PCA)對泡蘿卜品質進行評價。使用MEGA 7.0軟件繪制系統發育樹,使用SAS 9.0軟件進行PCA,使用Origin 2017軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 泡菜水中乳酸菌的分離鑒定

本研究共從5份泡蘿卜中分離出18株潛在乳酸菌菌株,其中17株為桿菌,1株為球菌,所有菌株在含有1.0%碳酸鈣的MRS上均能形成透明圈,且菌落呈乳白色,革蘭氏染色均為陽性,過氧化氫酶實驗均為陰性。在對18 株潛在乳酸菌菌株基因組DNA進行提取的基礎上,本研究進一步對16S rRNA基因進行了PCR擴增,同時采用瓊脂糖電泳技術對其擴增產物濃度和純度進行了檢測,結果如圖1所示。

由圖1可知,所有泳道在1500 bp左右均出現熒光條帶,條帶清晰、亮度較高且無明顯拖尾現象,因而所有潛在乳酸菌菌株16S rRNA基因PCR擴增成功,可用于后續清潔、連接、轉化和核苷酸序列測定。本研究進一步登陸NCBI網站,將各菌株反饋后的序列采用BLAST方法進行比對,選取相似度較高且已公布的乳酸菌模式種的16S rRNA基因序列構建系統發育樹,進而明確分離株的種屬分類學地位,系統發育樹如圖2所示。

由圖2可知,根據16S rRNA基因的系統發育分析,1株球菌鑒定為P.pentosaceus,而其他17株桿菌分別被鑒定為Lactobacillus的5個種,其中菌株HBUAS51059和HBUAS51060被鑒定為食品乳桿菌(L.alimentarius),菌株HBUAS51064、HBUAS51070和HBUAS51071被鑒定為L.brevis,菌株HBUAS51062和HBUAS51063被鑒定為副干酪乳桿菌(L.paracasei),菌株HBUAS51051和HBUAS51052被鑒定為發酵乳桿菌(L.fermentum),而其他8 株菌株均被鑒定為L.plantarum。由此可見,恩施地區泡蘿卜中乳酸菌具有較高的多樣性,且L.plantarum為其優勢乳酸菌類群,占分離株總數的44.44%。根據衛生部印發的《可用于食品的菌種名單》(2016版)規定,L.alimentarius不能用于食品的加工,因而本研究進一步使用除L.alimentarius外的16株乳酸菌分離株進行了泡蘿卜的純種發酵。

2.2 乳酸菌純種發酵泡蘿卜色澤和質構的評價

本研究分別采用色度儀對泡蘿卜水的色澤進行了數字化評價,同時采用質構儀對泡蘿卜的質構進行了測定,結果如表1所示。

表1 不同處理泡蘿卜水色度和泡蘿卜質構指標的比較分析Table 1 The comparative analysis of chromaticity indexeses of radish water and texture index of pickled radish by different treatments

由表1可知,由乳酸菌純種發酵制備的16份泡蘿卜水樣品的L*和a*值的中位數均大于自然發酵的泡菜水,這說明較之自然發酵,過半數乳酸菌菌株純種發酵制備的泡蘿卜水顏色偏亮和偏綠[17]。由表1亦可知,過半數乳酸菌菌株純種發酵制備的泡蘿卜硬度和脆性較之自然發酵組偏大,而咀嚼性偏小。由此可見,乳酸菌純種發酵對泡蘿卜水的色澤和泡蘿卜的質地均有明顯的影響,與本研究結論相同,汪立平等[18]開展了純種L.plantarum發酵低鹽蘿卜泡菜的研究,結果發現在降低食鹽用量的同時接入L.plantarum可保持泡菜的脆度。

2.3 乳酸菌純種發酵泡蘿卜典型風味物質的評價

在對泡菜水色澤和泡蘿卜質構進行評價的基礎上,本研究進一步使用電子鼻技術對不同泡蘿卜水中典型風味物質的含量進行了分析,結果如表2所示。

表2 不同處理泡蘿卜水中典型風味物質的比較分析Table 2 The significance analysis of volatile components in radish water by different treatment

由表2可知,傳感器W1C、W3C和W5C對乳酸菌純種發酵制備的16份泡蘿卜水響應值的中位數均大于自然發酵的泡菜水,而傳感器W1S、W2S、W2W和W3S對乳酸菌純種發酵制備泡蘿卜水響應值的中位數均小于自然發酵的泡菜水。由于傳感器W1C、W3C和W5C主要對芳香類物質敏感,而傳感器W6S、W1S、W2S、W2W和W3S主要對氫氣、甲烷、乙醇、有機硫化物和烷烴類物質敏感[20],因而接種多數乳酸菌菌株進行純種發酵可明顯提升泡蘿卜水揮發性風味物質中的芳香類物質,進而改善泡菜的風味品質。沈菲兒[19]研究結論與本研究相同,其發現乳酸菌純種發酵的蓮藕泡菜風味品質優于自然發酵,且純種發酵的蓮藕泡菜揮發性風味物種中醇類、醛類、烴類、酸類和烯類相對含量顯著增高。

2.4 基于主成分分析(PCA)乳酸菌純種發酵泡蘿卜品質

本研究基于PCA,采用降維的方法對乳酸菌純種發酵泡蘿卜的品質進行了進一步評價,第一主成分(principal component 1,PC1)、PC2、PC3和PC4的貢獻率分別為42.44%、22.34%、11.70%和10.27%,前4個主成分的累計方差貢獻率為86.75%。PC1由W1C、W5S、W3C、W5C和W2S 5個風味指標構成;PC2由W1W、W2W、L*和b*4個指標構成;PC3由脆性和咀嚼性2個質構指標構成;PC4由W6S、W1S、W3S、硬度和a*5個指標構成。較之色澤,消費者可能更為關注泡蘿卜的質地,因而本研究選取PC1和PC3進行了因子載荷圖的繪制,結果如圖3所示。

圖3 基于PCA的乳酸菌純種發酵泡蘿卜品質的因子載荷圖Fig.3 Factor loading diagram of product quality of pickled radish by pure breed fermentation of lactic acid bacterial strains based on PCA

由圖3可知,PC1中W5S和W2S兩個風味缺陷型指標偏向X軸正方向,W1C、W3C和W5C三個風味特征性指標偏向X軸負方向,PC3中脆性和咀嚼性指標偏向Y軸正方向,因而在因子得分圖中越偏向左上方的樣品其品質越佳,即排布于第二象限的樣品其品質最佳,排布于第一、三象限的次之,而排布于第四象限的品質最差。基于PC1和PC3的因子得分圖如圖4所示。

圖4 基于PCA的乳酸菌純種發酵泡蘿卜品質的因子得分圖Fig.4 Factor score diagram of product quality of pickled radish by pure breed fermentation of lactic acid bacterial strains based on PCA

由圖4可知,不同乳酸菌分離株純種發酵制備的泡蘿卜樣品在空間排布上較為分散,在4個象限均有分布,這說明不同菌株間的發酵特性差異較大,其中多數樣品的空間排布較自然發酵組偏左上方,因而這進一步證實了乳酸菌純種發酵可明顯提升多數泡蘿卜的品質。由圖4亦可知,菌株L.paracaseiHBUAS51063和L.plantarumHBUAS51053純種發酵制備的泡蘿卜樣品最偏左上方,因而該兩株菌具有相對較佳的發酵特性,可進一步用于后續泡菜用乳酸菌菌株的篩選。

3 結論

采用傳統微生物學和分子生物學手段相結合的方法對恩施地區泡蘿卜中乳酸菌的多樣性進行了解析,發現其乳酸菌隸屬于2個屬和6個種,具有較高的生物多樣性,且L.plantarum為優勢乳酸菌。在使用L.plantarum純種發酵泡蘿卜的基礎上,使用電子鼻和質構儀對其品質進行了評價,結果發現通過提升多數泡蘿卜水揮發性風味物質中的芳香類物質及泡蘿卜的硬度和脆性,L.plantarum純種發酵可明顯改善泡蘿卜的品質,其中菌株L.paracaseiHBUAS51063和L.plantarumHBUAS51053具有相對較佳的發酵特性,可進一步用于后續泡菜用乳酸菌菌株的篩選。