醬油渣中乳酸乳球菌分離鑒定及對模擬胃腸環境的耐受性

黃桂東 唐素婷 程云輝 孫張樂 陳梓琦 焦 葉 張 燦 鐘先鋒

(1. 佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東 佛山 528231；2. 廣東省傳統發酵食品工程技術研究中心，廣東 佛山 528231；3. 廣東省食品流通安全控制工程技術研究中心，廣東 佛山 528231；4. 佛山市釀造工程技術研究中心，廣東 佛山 528231；5. 佛山農業生物制造工程技術研究中心，廣東 佛山 528231；6. 長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114；7. 開平市佰益飼料科技發展有限公司，廣東 江門 529300)

醬油釀造是多種微生物協同作用的結果，每種微生物對醬油釀造過程的成分變化乃至醬油品質優劣均有一定影響[1-3]。醬油釀造過程涉及的微生物有曲霉、乳酸菌、酵母菌等[4]，其中，乳酸菌是參與醬油釀造最重要的細菌，主要包括乳桿菌屬[5]、乳酸乳球菌屬[6]、魏斯氏菌屬[6]、片球菌屬[4,6]等。醬油渣是醬油釀造后產生的殘渣，攜帶一定種類和數量的微生物，如乳酸乳球菌等[5-6]。目前大多數報道集中于對醬油釀造過程中乳酸菌的研究，查閱中國知網數據庫和Pubmed數據庫，尚未見有關醬油渣中乳酸乳球菌的報道，對醬油渣中乳酸菌的認識不足。

近年來，乳酸乳球菌因其良好的益生特性被廣泛應用于食品行業。部分乳酸乳球菌及其亞種能產生乳鏈菌肽[7-8]，是無毒的食品防腐劑，可用于食品防腐及保鮮[9]；乳酸乳球菌還可產胞外多糖，用于干酪[10]和豆腐[11]制作，其代謝產物能夠改善產品的流變學特性等。

為了深入挖掘乳酸菌資源并延伸醬油渣的可利用價值，試驗擬采用傳統菌株篩選方法，從醬油渣中分離、篩選、鑒定乳酸乳球菌，并對其部分益生特性進行研究，以期為食源性乳酸菌資源庫擴充提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

醬油渣：原料主要是大豆與小麥粉，采用高鹽稀態工藝釀造，廣東某調味食品有限公司;

過氧化氫生化鑒定管、革蘭氏染色試劑盒、硫化氫生化鑒定管、吲哚生化鑒定管、硝酸鹽(還原)生化鑒定管、明膠生化鑒定管、MRS肉湯等：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

防凍霜冰箱：BCD-189WDPV型，海爾股份有限公司；

顯微鏡：PH100型，鳳凰光學集團有限公司；

恒溫培養箱：LRH-150型，上海一恒科學儀器有限公司；

全自動滅菌鍋：GR60DA型，致微(廈門)儀器有限公司；

電子分析天平：ME104型，梅特勒—托利多精密儀器公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 醬油渣中乳酸菌的分離與純化 根據文獻[12-14]修改如下：稱取醬油渣樣品10 g溶解于90 g無菌生理鹽水中，制成10-1,10-2,……,10-6共6個濃度稀釋液。吸取稀釋液0.1 mL，涂布于含3 g/100 mL碳酸鈣的MRS固體培養基中，37 ℃倒置培養24～36 h。挑取菌落劃線2～3次至菌落一致。挑取單菌落37 ℃培養12 h，與甘油混合，-20 ℃保藏。

1.2.2 醬油渣中乳酸菌的鑒定

(1) 形態學觀察：根據文獻[15]修改如下，菌株劃線培養于MRS固體培養基，37 ℃培養48 h，觀察菌株的菌落形態。進行革蘭氏染色試驗，使用油鏡，觀察菌株的菌體形態。革蘭氏陽性菌株進行過氧化氫酶接觸試驗，有氣泡產生為陽性反應，無氣泡產生為陰性。

(2) 生理生化試驗：參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[16]，具體試驗操作參考生化鑒定管說明書。

(3) 分子生物學鑒定：將革蘭氏呈陽性、過氧化氫酶接觸試驗呈陰性菌株送往華大基因進行菌株的16S rRNA 序列測序。

(4) 系統發育樹的構建：根據文獻[17-18]修改如下，登陸GenBank中BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)比對測序菌株，并查詢模式菌株信息，利用Mega 5.0軟件，使用鄰近算法，BacillussubtilisNCDO1769為外群菌株，bootstrap為1 000構建系統發育樹。

1.2.3 乳酸乳球菌生長曲線測定 根據文獻[19]修改如下：菌株活化3代，調節OD600 nm為(1.00±0.05)，按照2%(體積分數)的接種量接種于MRS肉湯培養基，37 ℃恒溫培養，以未接種的MRS液體培養基為陰性對照，分別培養0，2，4，6，8，10，12，16，20，24，28，32，36，40 h，使用酶標儀測定菌株的OD600 nm，記錄數據并繪制生長曲線。

1.2.4 乳酸乳球菌模擬胃液耐受性測定 根據文獻[12,20]修改如下，菌株活化3代，吸取4 mL菌液，5 000 r/min 離心8 min，去上清液，將菌體懸浮于4 mL滅菌生理鹽水制成菌懸浮液。無菌離心管中加入4.5 mL人工胃液、0.5 mL菌懸浮液，混合均勻。37 ℃培養，分別在0(稀釋度為10-4，10-5，10-6)，3 h(稀釋度為10-3，10-4，10-5)取樣0.1 mL，使用平板計數法計算菌株存活率。設置3個平行，按式(1)計算菌株存活率。

(1)

式中：

S1——菌株存活率，%；

A0——耐受人工胃液0 h的活菌數，CFU/mL；

A1——耐受人工胃液3 h的活菌數，CFU/mL。

1.2.5 乳酸乳球菌模擬腸液耐受性測定 根據文獻[12,20]修改如下，取人工胃液消化3 h的菌株培養液0.5 mL，接種于4.5 mL人工腸液中，37 ℃培養0(稀釋度10-3，10-4，10-5)，4 (稀釋度10-2，10-3，10-4)，8 h(稀釋度10-2，10-3，10-4)，使用平板計數法計算菌株存活率。設置3個平行，按式(2)計算菌株存活率。

(2)

式中：

S2——菌株存活率，%；

A0——人工腸液耐受0 h的活菌數，CFU/mL；

As——人工腸液耐受4 h或8 h的活菌數，CFU/mL。

1.3 數據處理

數據統計與處理采用Excel 2013以及SPSS 17.0，繪圖采用Origin 9。

2 結果與分析

2.1 乳酸乳球菌形態學觀察

從醬油渣中分離得到4株乳酸乳球菌，分別為菌株HT122、HT127、HT223、HT227，菌落顏色為灰白色，菌落表面光滑，邊緣齊整，直徑為0.3～1.0 mm。經染色試驗發現4株乳酸菌均為革蘭氏陽性菌，菌體均為球狀，呈單個、成對或短鏈分布。醬油渣中部分乳酸乳球菌的菌體形態如圖1所示。

圖1 部分乳酸乳球菌菌株的菌體形態

Figure 1 Microscopic morphology of partialLactococcuslactisfrom soy sauce residue (×1 000)

2.2 乳酸乳球菌生理生化試驗特征

由表1可知，菌株HT122、HT127、HT223和HT227的革蘭氏染色試驗菌體均呈紫色，過氧化氫酶接觸試驗、硝酸鹽還原反應、葡萄糖產氣試驗、6.5% NaCl生長試驗及45 ℃生長試驗均呈陰性。參考雷霞[21]、華鶴良[22]的方法，結合形態學研究結果，初步判斷以上4株菌為乳酸乳球菌屬(Lactococcus)。

表1 乳酸乳球菌生理生化鑒定結果?Table 1 Results of the biochemical identification of Lactococcus lactis from soy sauce residue

? “+”表示反應呈陽性；“-”表示反應呈陰性、不生長或生長不明顯。

2.3 乳酸乳球菌分子生物學鑒定

對4株乳酸乳球菌進行基因組提取、16S rRNA基因PCR擴增、測序，所得凝膠電泳圖如圖2所示。由圖2可知，4株乳酸乳球菌PCR產物大小均在1 500 bp左右，且條帶清晰無彌散。

得到菌株的16S rRNA基因序列，進行Blast比對，結果如表2所示。利用Mega 5.0軟件構建系統發育樹，如圖3所示。由圖3可知，菌株HT122、HT127、HT223、HT227均與模式菌株Lactococcuslactissubsp.lactisJCM 5805T、Lactococcuslactissubsp.hordniaeNBRC 100931T處于同一分支。結合表2，將菌株HT127、HT223、HT227鑒定為Lactococcuslactissubsp.hordniae(乳酸乳球菌霍氏亞種)；將菌株HT122鑒定為Lactococcuslactissubsp.lactis(乳酸乳球菌乳亞種)。Ansah[6]研究也發現醬油發酵過程中存在乳酸乳球菌。

電泳條件：3 μL樣品+1%瓊脂糖凝膠，使用Trans 2K@Plus RNA Marker

圖2 乳酸乳球菌16S rRNA PCR擴增產物電泳圖

Figure 2 Electrophoresis of 16S rRNA amplified products ofLactococcuslactisfrom soy sauce residue

表2 醬油渣中分離菌株的16S rRNA 序列同源性比對結果Table 2 Results of 16S rRNA sequence homology analysis of Lactococcus lactis from soy sauce residue

0.02表示2%替換率

2.4 乳酸乳球菌生長曲線

由圖4可知，從醬油渣中分離得到的4株乳酸乳球菌的生長趨勢總體相似。0～2 h為延遲期，2～12 h 為對數生長期，接種12 h后，菌株生長速率減緩，進入生長穩定期。

圖4 乳酸乳球菌菌株生長曲線Figure 4 Growth curves of Lactococcus lactis from soy sauce residue

2.5 乳酸乳球菌模擬胃液耐受能力

胃液主要由黏液、鹽酸、胃蛋白酶組成，在胃液作用下，微生物的活菌數會逐漸減少。由于微生物需要超過一定數量才能對機體發揮益生特性，因此需要考察乳酸乳球菌的胃液耐受能力[23]。由圖5可知，菌株HT223的模擬胃液耐受能力較好，耐受胃液3 h后，菌株存活率為(94.85±0.05)%；菌株HT127、HT227、HT122耐受胃液3 h后，菌株存活率分別為(81.67±0.25)%，(77.99±0.58)%，(58.57±0.57)%。迪娜熱爾·迪力達西等[24]對從新疆傳統發酵乳品中分離出的乳酸乳球菌進行胃液耐受能力試驗，發現其3 h存活率達94.27%。說明不同菌株對人工胃液耐受能力有差異。

圖5 乳酸乳球菌在模擬人工胃液中的存活率

Figure 5 Test results of live bacteria counts ofLactococcuslactisin simulated artificial gastric juice

2.6 乳酸乳球菌模擬腸液耐受能力

腸液主要成分為胰液和膽汁。胰液中的胰蛋白酶可水解微生物的菌體蛋白質，抑制乃至殺死微生物。膽汁中含有一定量膽鹽，膽鹽在人體腸道的濃度為0.03%～0.30%，能改變微生物細胞膜的通透性，抑制、殺死進入腸道的微生物[25]。微生物到達小腸后，因胰蛋白酶、膽鹽的抑制作用及營養的缺乏等因素逐漸死亡[12]。因此，需評估乳酸菌對腸液的耐受能力。由圖6可知，菌株HT127耐受腸液能力較好，耐受腸液4，8 h后的菌株存活率分別為(93.61±0.67)%，(67.42±0.72)%；菌株HT227耐受腸液能力較差，耐受模擬腸液4，8 h的菌株存活率分別為(26.83±0.13)%，(22.28±0.18)%。結合4株乳酸乳球菌模擬胃液耐受能力的結果，發現菌株HT127耐受模擬胃液、腸液能力較好。

圖6 乳酸乳球菌在模擬人工腸液中的存活率

3 結論

從醬油渣中分離得到了4株乳酸乳球菌，經鑒定，分別屬于Lactococcuslactissubsp.hordniae(乳酸乳球菌霍氏亞種)和Lactococcuslactissubsp.lactis(乳酸乳球菌乳亞種)。對其體外模擬胃腸環境耐受能力研究發現，菌株HT127耐受模擬胃腸環境能力較好。后續可對其生長特性、益生特性等進行深入研究與探討，為乳酸乳球菌資源庫的豐富提供科學依據。