小鼠不同生長階段骨骼肌組織中Myf5 的表達

冀云燕，薛霖莉，2，曹 靖，李藝雷，任華偉，羅小毛，于秀菊，赫曉燕，耿建軍

（1.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801；2.山西農業大學信息學院，山西太谷030800；3.北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京102442）

肌源性因子5（Myogenic factor 5，Myf5）是肌源性調節因子家族成員，是骨骼肌調節基因[1]，負責脊椎動物胚胎的骨骼肌生成[2]，在骨骼肌形成初期對肌原細胞增殖分化起主要作用[3]，與肌原性分化密切相關[4]。

DUPREZ 等[5]研究發現，Myf5 可以在體外迫使非肌肉細胞中的肌原性轉化，Myf5 表達與成肌細胞增殖相關。KURYL 等[6]研究認為，Myf5 基因對于豬屠體瘦肉的含量和眼肌肉的面積都具有非常重要的影響。LIU 等[7]研究發現，在大白豬×梅山豬的F2群體之中，Myf5 基因的Hsp9211 位點對豬背最長肌的肌間脂肪（P＝0.04）和吸水力都有非常明顯的影響（P＝0.000 1）。孫文浩[8]對雞的研究表明，Myf5基因的單倍型組合對于雞的胸肌質量、腿肌質量、活體質量、屠體質量具有非常明顯的影響（P＜0.05），而且Myf5 基因單倍型組合也對肌纖維的密度以及肌纖維的直徑都有顯著影響（P＜0.05）。BEAUCHAMP[9]研究發現，Myf5 的表達與骨骼肌衛星細胞密切相關，Myf5 缺失小鼠表現出在凍傷后肌纖維肥大，延遲分化，脂肪細胞積聚和纖維化顯著增加[10]，缺乏Myf5 小鼠不能形成成肌細胞[11]。FRIDAY 等[12]研究發現，Myf5 在骨骼肌的測定、發育和分化中起重要作用，在衛星細胞被激活時最先表達Myf5[13]，Myf5 能夠將許多非肌肉細胞轉化為肌肉[14]。

本試驗通過研究Myf5 基因在小鼠不同發育階段骨骼肌組織中的表達情況，探索其在小鼠骨骼肌組織表達的規律，旨在揭示骨骼肌生長發育的調控機制，為后續Myf5 基因的功能研究以及肌肉疾病的預防、治療提供相關理論依據

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 共選取16 只健康小鼠，即幼齡小鼠（7 日齡）、性成熟小鼠（21～28 日齡）、體成熟小鼠（42～56 日齡）和老齡小鼠（84 日齡以上）各4 只，均由山西農業大學試驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 氯仿、異丙醇、無水乙醇（天津天大化工）、RNAisoPlus、PrimeScriptTMRTreagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR PremixExTap（Takara）、Myf5 抗體（三鷹）、β-actin（三鷹）等；高壓蒸汽滅菌器（Sabyo 公司）；光學顯微鏡（Leica 公司）、普通MYF5 儀（Bio-Rad 公司）、Mx3000P 實時熒光定量PCR 儀及相應的檢測軟件（Agilent）、高速冷凍離心機（Sigma 公司）、凝膠成像儀（Panasonic 公司）、超凈工作臺（SW-CJ-CO 型，蘇州市華宇凈化設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 取材 通過斷頸使小鼠安樂死，將小鼠用70%酒精徹底噴灑（以防止小鼠皮毛污染），用鑷子拾起腹部皮膚，然后用鋒利的剪刀做一個縱向切口，沿相反方向剝去皮膚，沿脛骨兩側插入和延伸剪刀，切除腓腸肌，分為2 份，一份快速放入液氮速凍，一份放入固定液固定。

1.2.2 引物設計與合成 試驗所用引物均根據GenBank Myf5 基因對應（登錄號：17877）的小鼠序列，采用Premier 5.0 軟件進行實時熒光PCR 引物設計，由北京華大公司合成（表1）。

表1 引物序列信息

1.2.3 普通PCR 擴增 以小鼠骨骼肌cDNA（100 ng/μL）為模板，10 μL 體系進行普通PCR 擴增：2×Taq Master Mix 5 μL，待測上游引物0.4 μL，待測下游引物0.4 μL，cDNA 100 ng，ddH2O 補足10 μL。PCR 擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，梯度退火溫度30 s，72 ℃延伸20 s，35 個循環；72 ℃終止延伸5 min。產物進行1%瓊脂凝膠電泳。

1.2.4 實時熒光定量PCR 以小鼠骨骼肌cDNA（100 ng/μL）為模板，10 μL 體系進行實時熒光定量PCR：SYBR Premix Ex Taq（2×）5 μL，待測基因上游引物0.4 μL，待測基因下游引物0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ0.2 μL，CDNA 100 ng，ddH2O 補足10 μL。實時熒光定量PCR 擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35 個循環。用2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.2.5 組織包埋、石蠟切片制作及HE 染色Bouins 固定脫蠟，梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋，凝固后4 ℃長期保存。石蠟切片去5 μm厚，常規HE 染色后使用中性樹脂封片。用顯微鏡觀察組織不同發育階段形態學差異。

1.2.6 免疫組織化學分析 脫蠟、封閉內源性過氧化物酶與阻斷異性抗原、滴加已稀釋一抗（4 ℃過夜），滴加二抗（37 ℃30 min），顯色、復染、脫水與封片、鏡檢。

2 結果與分析

2.1 小鼠不同生長時期骨骼肌的組織形態學變化

從圖1 可以看出，幼齡小鼠的細胞核多位于細胞邊緣，肌纖維的橫切面近似圓形；性成熟、體成熟小鼠的肌纖維多排列致密，呈簇排列，胞核多位于周邊，肌纖維的橫切面近似多邊形；老齡小鼠肌纖維排列松散，肌束間間隙增大。表明從幼齡到體成熟階段，隨著年齡的不斷增加，肌纖維在不斷生長，肌纖維的直徑不斷增加，肌纖維的橫切面由近似圓形逐漸變為多邊形，肌束排列更加緊密；而在老齡階段，肌束間的間隙逐漸增大。

2.2 小鼠不同生長時期骨骼肌中Myf5 的表達

由圖2 可知，陽性組和陰性組明顯不同，陰性組細胞核呈現藍色，胞質為淡粉色。表明Myf5 的表達定位于細胞核中，Myf5 在幼年、體成熟、性成熟、老年小鼠的4 個不同發育階段的骨骼肌中均有表達，且免疫組織化學結構染色深淺不一，陽性組幼齡階段著色較深。表明Myf5 在幼年階段的表達量較多，而在性成熟、體成熟、老年階段的表達量相對較少。

2.3 Myf5 基因在小鼠不同生長時期骨骼肌中的表達

為了選出Myf5 基因的最佳退火溫度，在PCR 擴增過程中設置溫度梯度54.0～61.0 ℃，中央57.5 ℃，跨度7.0 ℃，根據擴增的產物進行瓊脂凝膠電泳。由圖3 可知，產物片段為172 bp，第3 泳道無雜帶，而且清晰明亮，沒有拖尾現象。因此，最適的退火溫度為57.5 ℃。

2.4 Myf5 mRNA 在小鼠不同生長時期骨骼肌中的表達變化

由圖4，5 可知，擴增溶解曲線基線單一，基本平直，無明顯的上揚趨勢，說明定量的曲線符合預期，可以用于試驗。按照試驗過程中的定量結果，應用統計學的方法對試驗數據進行處理，并繪制圖6，結果顯示，Myf5 mRNA 在小鼠4 個不同發育階段均有表達，但表達存在差異性。幼年小鼠、性成熟小鼠、體成熟小鼠的Myf5 mRNA 表達極顯著低于老年小鼠（P＜0.001），Myf5 mRNA 的表達量與小鼠的生長發育階段有一定的相關性。

3 結論與討論

肌源性因子5 是一種人體內由Myf5 基因編碼的蛋白質[15]，在調節肌肉分化或肌生成，特別是骨骼肌的發育中發揮關鍵作用[16-17]。Myf5 在肌源性分化中起著重要作用[18]。此外，Myf5 是肌肉發育的主要調控因子，在成纖維細胞中表達時，具有誘導肌肉表型的能力[19]。研究發現，Myf5 在早期體細胞的皮肌組中表達，能促使肌源性前體分化為成肌細胞[20]，肌生成方面發揮作用的同時，也間接控制了近端肋骨的發育與骨骼肌再生[21-23]。Myf5 是衛星細胞的關鍵細胞標志物之一，在肌肉損傷再生中起著重要作用[24]，當肌肉發生損傷時，處于靜止狀態的衛星細胞被激活，通過增殖、分化后重新形成新的骨骼肌細胞，從而實現骨骼肌損傷修復[25]。

SMITH 等[26]研究發現，Myf5 在不同階段均有表達。BRAUN 等[27]研究發現，Myf5 是成肌特化的主要調節因子，其不僅決定了成肌細胞的早期命運，而且也在成肌細胞的早期分化中起著重要的作用，Myf5 與失神經骨骼肌萎縮的發生有關。本試驗探究Myf5 在不同發育階段小鼠骨骼肌的表達定位，結果顯示，Myf5 在小鼠的不同發育階段骨骼肌上均有表達，但表達量各有不同，其中，幼年、性成熟、體成熟小鼠中Myf5 表達量顯著低于老年小鼠。表達量與小鼠心肌細胞的發育具有相關性。曹婷等[28]對五指山豬的研究表明，在出生后的五指山豬的背部肌肉組織中的表達水平與其生長的年齡成正比（P＜0.05）。魏園丁等[29]對鴨胸肌的研究顯示，胸肌和腿肌中Myf5 的表達量分別在27，14 胚齡達到高峰隨后緩慢降低。張濤等[30]對京海黃雞的研究發現，Myf5 基因在幼齡時期表達量最高，隨著年齡增長呈下降趨勢。在損傷的情況下細胞周期激活，這可能是因為Myf5 基因突變型導致數量增加的原因，且不能排除Myf5 基因的積累，是造成小鼠骨骼肌Myf5 表達在老年期高的原因。