穴注加貼敷對哮喘大鼠血清IL-10、IL-17和肺組織ICAM-1表達的影響*

耿立梅，閆紅倩，于向艷，馬璇雯，牛曉艷

(1. 河北省中醫院呼吸一科, 石家莊 050011； 2. 石家莊市中醫院呼吸科，石家莊 050000；3. 鄭州市管城中醫院內科，鄭州 450000)

哮喘是一種呼吸道慢性炎癥性疾病，具有復雜的發病機制。研究證實，ICAM-1、IL-10以及IL-17在哮喘發生發展中發揮了重要作用。ICAM-1參與呼吸道炎癥形成的早期階段，可介導白細胞在呼吸道黏膜的黏附和轉移；IL-10在炎癥早期可抑制促炎因子、 趨化因子的合成，阻斷炎癥細胞釋放促炎性細胞因子；IL-17是T 細胞誘導的炎癥反應的啟動因素，對炎癥細胞有強大的化學趨化作用。 Treg/Th17細胞及其相關細胞因子IL-10/IL-17比例失衡是哮喘發病的重要基礎。中醫的貼敷及穴注治療哮喘的療效也被研究所證實。本研究旨在探討穴注加貼敷對哮喘大鼠血清IL-10、IL-17和肺組織ICAM-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

雄性Wistar SPF級大鼠60只，體質量(120±20) g，由河北醫科大學實驗室提供。將動物按隨機數字表法分為正常組(A)、模型組(B)、貼敷組(C)、穴位注射組(D)和貼敷組+穴位注射組(E)各12只。

1.2 主要試劑和儀器

雞卵蛋白(Sigma),氫氧化鋁(分析純，成都科龍化工試劑廠),IL-10定量酶檢測試劑盒(北京普爾偉業生物科技有限公司), IL-17定量酶分析試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)，免疫組化試劑盒：一抗：兔抗小鼠ICAM-1(北京博安生物科技有限公司)，二抗：山羊抗兔 IgG抗體-HRP多聚體(北京中山金橋生物技術)，顯微圖像分析系統HMIAS-2000(武漢同濟醫科大學)，數碼顯微鏡 DP73(Olympus公司),草分枝桿菌 FU36 注射液1.72 μgml(成都金星健康藥業有限公司),貼敷(河北省中醫院呼吸科)。

1.3 造模方法

在第1天和第8天給予腹腔注射OVA和氫氧化鋁懸浮液1 mL[1-2]，并給予正常組注射相同量的生理鹽水。 在第15天將大鼠置于獨立的密封霧化箱中進行霧化，并用2%OVA溶液進行超聲霧化。 每天1次用生理鹽水替換正常組，每次30 min。 各組大鼠的行為發生了變化。 在霧化組中，有呼吸短促、咳嗽、煩躁、點頭，甚至四肢柔軟易發，尿失禁和大小便失禁。 挑戰持續7 d，然后每周2次。

1.4 實驗方法

在成功建模后的第22天開始干預。 穴位大椎、雙頂川、雙肺、脾、雙腎服用。 剃須后，食欲組大鼠剃毛， 發表于6 h; 穴位注射組注射穴位結核，5組穴位輪流取穴，每穴5 μl; 在應用組中應用穴位，然后應用中藥6 h，模型組用相同的治療組治療。 更換相同量的生理鹽水和空貼紙,每隔1 d操作1次，每次治療3次，共4個療程。

1.5 標本采集

在實驗結束時，將大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml / 100 mg)麻醉，以仰臥位固定，并將動脈血從右側腹股溝取出至血液收集管。 將管放置30 min，以3000 r/min離心并分配血清,收集放入冷凍管中，在-20℃冷凍備用; 將大鼠的胸腔暴露于胸中線，將右肺中葉置于10%甲醛溶液中固定，在-20℃冷凍備用; 將大鼠的胸腔暴露于胸中線，將右肺中葉置于10%甲醛溶液中固定。

1.6 指標檢測

1.6.1 HE染色 右肺中葉常規石蠟包埋、切片，常規HE染色。

1.6.2 ELISA檢測 酶標儀采用HBS-1096C Pro自動酶標儀(上海珂淮儀器有限公司)，IL-10和IL-17的ELISA檢測試劑盒分別為北京普爾偉業生物科技有限公司上海森雄科技實業有限公司生產。根據試劑盒說明書嚴格操作，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清IL-10、IL-17水平。

1.6.3 免疫組化檢測 嚴格按照SABC免疫組化試劑盒說明操作：切片常規脫蠟脫水→3%雙氧水滅活內源性過氧化物酶→滴加一抗(兔抗鼠 ICAM-1，1∶100稀釋)37 ℃孵育4 h→滴加二抗(羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體， 1∶200稀釋) →37 ℃孵育20 min→滴加SABC 37 ℃孵育20 min→DAB顯色，鏡下控制反應時間5 min，蒸餾水終止反應→脫水封片→光鏡下觀察、照相和分析。

根據盲法原則，采用日本OLYMPUS公司的AX-70顯微成像系統進行觀察分析及照相，每只大鼠取6張切片，每張切片隨機取2個視野照相。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統，測定ICAM表達的平均光密度值(IOD)。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 肺組織HE染色

圖1顯示，氣管周圍及肺組織內的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等炎性細胞HE染色后呈藍色。對照組：細支氣管上皮完整，形態規則，支氣管壁不增生，肺泡形態規則，肺泡壁規則；模型組：氣管和肺組織周圍有大量炎性細胞浸潤，支氣管狹窄，上皮細胞分離，黏膜水腫，肺泡腔明顯變小;穴位組：與模型組比較，炎癥細胞浸潤減少，支氣管形態略微縮小，肺泡形態不規則;貼片組：與模型組比較，細支氣管形態較正常，腔內無明顯上皮細胞脫落，壁內炎癥細胞，肺泡形態不完善;穴位注射+貼片組：細支氣管形態規則，管周圍可見小炎癥細胞，黏膜正常，肺泡腔形態較規則，個別肺泡壁增厚，炎癥細胞增多。

2.2 各組血清IL-10、IL-17和IgE含量比較

表1顯示，血清IL-10、IL-17和IgE含量統計學比較顯示，模型組大鼠IL-17、IgE高于正常組，IL-10低于正常組，差異顯著(P<0.05)；3個治療組的IL-17和IgE均低于模型組，IL-10高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。 IL-17含量：應用組+注射組低于應用組和注射組， 差異有統計學意義(P<0.05); 穴位組與斑塊組之間比較差異無統計學意義(P> 0.05)。 IgE含量：貼劑+穴位注射組的應用低于穴位注射組和應用組(P<0.05)。 穴位注射組與放置組之間比較差異無統計學意義(P> 0.05)。 IL-10含量：貼劑+穴位組高于貼劑組和空穴注射組，差異有統計學意義(P<0.05)，穴位組與貼劑組比較差異無統計學意義(P> 0.05)。

2.3 各組大鼠肺組織ICAM-1的表達比較

表1圖2顯示，在正常組支氣管周圍觀察到少量棕黃色陽性細胞， 模型組在支氣管和支氣管分泌物以及間質和肺泡棕黃色顆粒周圍具有更多表達。 ICAM-1的平均光密度高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。 應用組和穴位組中的棕黃色顆粒小于模型組。 ICAM-1的表達水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。 斑塊+穴位組中棕黃色陽性細胞表達不明顯。 與注射組比較，ICAM-1的平均光密度低，差異有統計學意義(P<0.05)。 穴位組和貼劑組之間比較差異無統計學意義(P> 0.05)。

3 討論

支氣管哮喘(下稱哮喘)是一種呼吸道慢性炎癥性疾病，其病理生理學機制包括炎癥細胞、炎癥介質與呼吸道組織和細胞間的復雜相互作用，導致急性支氣管痙攣，呼吸道壁水腫，黏液分泌增加和呼吸道重構,從而引起呼吸道阻塞。此外，炎癥還可以引起呼吸道反應性增高。近年來的研究發現，支氣管哮喘的發病機制主要與免疫反應有關，其中，呼吸道炎癥是哮喘發病的主要原因之一。本實驗中，模型組血清IL-10含量明顯低于對照組，表明在哮喘的炎癥階段IL-10的含量減低。IL-10是一類強大的免疫抑制因子，主要由CD4+CD25+ Tregs 細胞合成分泌。此外，TH2、TH1淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞也都是其來源[3]。IL-10可抑制促炎因子、趨化因子的合成以及與受體的結合，并且阻斷炎癥細胞釋放促炎癥細胞因子[4]。缺乏IL-10可能是哮喘的重要原因。 通常認為，Th1 / Th2細胞因子的比例是不平衡的，并且TH2細胞因子的優勢是哮喘的免疫學基礎。 最近的研究發現，Treg / Th17細胞及其相關細胞因子IL-10 / IL-17的失衡也是哮喘發病機制的重要病理生理基礎[5]。

表1 各組血清IL-10、IL-17、IgE含量及ICAM-1在肺組織中IOD值表達比較

注： 與模型組比較：*P<0.05； 與穴注組比較：#P<0.05；與貼敷組、穴注組比較：△P<0.05; 與貼敷組、穴注組比較：▲P<0.05

圖1 各組大鼠肺組織HE染色比較

圖2 各組大鼠肺組織ICAM-1表達比較(免疫組化分析)

本研究結果顯示，模型組大鼠血清IL-17明顯高于正常組，差異有統計學意義。這與文獻關于IL-17具有促炎作用的研究相符合，提示IL-17對哮喘炎癥反應的促進作用。有研究顯示，IL-17水平可以作為評估嚴重支氣管哮喘的獨立危險因素[6]。哮喘大鼠氣道的高反應性依賴于TH17細胞應答及中性粒細胞浸潤，表明TH17細胞及其細胞因子IL-17是促進哮喘加重的關鍵因素[7]。實驗中的模型組大鼠血清IL-17含量明顯高于正常組，而IL-10低于正常組，經穴位貼敷組、穴位注射組、穴位注射+貼敷組治療后大鼠的血清IL-17含量較模型組降低，IL-10含量較模型組升高。同時HE染色顯示，血管周圍有少量炎癥細胞，支氣管形態規則，黏膜正常，肺泡腔形態規則。 上述結論進一步表明，Treg細胞和TH17細胞之間的失衡是哮喘的重要原因[8]，Treg細胞分泌IL-10減少，可導致免疫細胞失衡而發生哮喘，而IL-10與IL-17的表達失衡，從某種方面也反映了Treg/TH17的失衡狀態。

該研究中的另一個指標是細胞間黏附分子-1(ICAM-1)，在從血管到炎癥部位的白細胞如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等積累中起關鍵作用[9]。 ICAM-1主要在白細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞和肺組織中表達。當哮喘發生時，ICAM-1可以介導和促進上述細胞的黏附[10]。有研究表明，ICAM-1與哮喘的呼吸道炎癥有密切聯系，使用抗ICAM-1單抗能夠改善哮喘動物模型呼吸道的炎癥細胞浸潤[11]。也有研究推斷[12]， ICAM-1能夠協同炎性因子加快嗜酸粒細胞等炎癥細胞向氣道浸潤，ICAM-1對于氣道炎癥程度的影響很大。模型組大鼠肺組織免疫組化的平均積分光密度(OD)值明顯高于正常對照組，表明在哮喘大鼠的炎癥階段，ICAM-1的表達增強，減少ICAM-1的表達，可以減少氣道炎癥從而控制哮喘。

傳統醫學的內病外治常配合穴位敷貼來完成。 穴位敷貼對于藥物有放大和增敏作用[13]。貼敷藥物由白芥子、延胡索、甘遂、細辛、百部、五味子、前胡、麻黃組成。上述藥研磨過篩，加用姜汁、香油調制，選用辛香走竄之品，具有辛溫散寒平喘之功，配以行氣化痰、斂肺平喘藥物，達到祛痰鎮咳平喘的作用。加之對以上穴位的刺激，肺、脾、腎三臟同調，達到宣肺理氣、健脾化痰、培元固本的作用。此外，草分枝桿菌是一種滅活的非病原性細菌[14]，能夠促進外周血單個核細胞產生γ-IFN、IL-4，促進TH細胞成熟，上調TH1細胞功能，從而調節Th1 /Th2的平衡，起到防治哮喘的作用[15]。并且能夠提高機體IgG、IgM的水平，從而調整T細胞亞群的含量，發揮提高免疫功能的作用[16]。本實驗將草分枝桿菌作為穴位注射藥物注射于哮喘大鼠模型，為草分枝桿菌的應用尋找新的注射方法，也是尋找哮喘防治更有效的手段。穴位敷貼組、穴位注射組、穴位注射+黏連組ICAM-1的表達均低于模型組，表明3種方法均有效。 穴位組和斑塊組之間比較差異無統計學意義，穴位暴露組ICAM-1表達低于其他組。 結果表明，3種方法均可通過降低肺組織ICAM-1的表達，抑制炎癥細胞的積聚，減輕哮喘的癥狀。 應用效果與穴位注射相似，穴位注射聯合應用效果更好。

綜上所述，穴位注射聯合貼敷可提高哮喘大鼠血清IL-10含量，降低IL-17、IgE水平及ICAM-1的表達。