不同栽培模式對辣椒根際連作土壤微生物區系和酶活性的影響

董宇飛，呂相漳，張自坤，賀洪軍，喻景權，周艷虹，*

(1.浙江大學 園藝系，浙江省園藝作物整合生物學重點實驗室，浙江 杭州 310058；2.德州市農業科學研究院，山東 德州 253015)

土壤連作會造成土壤養分不均衡，土壤肥力降低，植株根系活力下降，植株長勢變差[1]。據調查，隨著辣椒種植面積的擴大和連作年限的增加，連作障礙日益嚴重，輕者減產30%左右，嚴重的減產60%以上，甚至絕產[2]。連作障礙發生的原因很多，其主要原因是連續單一種植同一作物導致作物根際微生態平衡失調、微生物種群結構失衡、微生物總數和土壤酶活性下降[3]。因此，采用合理的耕作制度，如不同作物合理輪作、適當作物間作等措施，是提高土壤質量及作物產量的重要手段。

眾多研究表明，輪間作系統通過維持土壤微生物群落的多樣性和活動，抑制單一栽培中的有害微生物而增加有益微生物活性和數量，提高土壤酶活性來提高作物產量[4-6]。比如，西瓜與水稻水旱輪作的模式，減少了土壤中的根結線蟲，降低了西瓜枯萎病及水稻紋枯病發病率，改善了土壤的微生態系統[7]；大蒜與油菜間作減輕大蒜白腐病發生[8]；Khan等[9]采用胡椒間作大蒜通過改變酶活性和土壤微生物種群來提高土壤肥力。栽培方式不同，對土壤肥力和質量提升程度不同，導致土壤可培養微生物數量、微生物種類和土壤酶活性也不同，而這些差異又會對土壤生理生化性質及生產力產生重要影響，因此，土壤微生物生物量和酶活性等特性可以作為衡量土壤質量的生物指標[10]。

在辣椒生產中，輪作或者間作有利于緩解連作障礙進而提高辣椒產量這一點早已廣為人知并得以應用，但對于輪作和間作有利的原因，尤其是其土壤微生物學機制尚未明確。因此，本研究主要從土壤微生物和酶活性方面探討輪間作模式對于辣椒連作障礙的影響，分析不同栽培模式辣椒土壤微生物結構和群落多樣性差異，以及輪間作處理對連作辣椒土壤酶活性的影響，以期為克服辣椒連作障礙提供理論依據，并且提供一定的實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

供試土壤樣品取自山東省德州市農業科學院，試驗在同一地區相鄰地塊共設9個小區，進行連作3年辣椒、玉米-辣椒間作3年、大蒜-辣椒輪作3年3個處理，每個處理各隨機占3個小區，小區之間由挑溝進行分隔，供試辣椒品種為德紅2號。在進行該試驗之前，各處理土壤化學特征相似：土壤pH值為7.96±0.05，EC值為(773±11)μS·cm-1，有機質含量為(11.712±0.857)g·kg-1。試驗地區50%以上為潮土類，堿解氮含量屬中等水平，速效磷含量較高，速效鉀含量一般，當地農民常規栽培管理。土壤樣品的采集于2017年8月末辣椒成熟期進行。在每個處理小區按五點取樣法隨機取樣，即選擇長勢均勻并具有代表性的5株辣椒，用直徑約5 cm的土鉆取距辣椒植株約5 cm處、0～20 cm深的根際土樣作為一個樣品，混勻并挑除雜質放入取樣袋帶回實驗室。之后一部分于4 ℃冰箱內冷藏用于稀釋平板法測可培養微生物數量；一部分置于陰涼處風干，過2 mm篩用于土壤酶活性的測定；另一部分樣品裝在滅過菌的50 mL離心管內置于-80 ℃超低溫冰箱內冷凍保存，用于高通量測序分析微生物群落結構。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 土壤微生物數量測定

采用稀釋平板計數法進行微生物檢測[11]，細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基培養，選擇10-4、10-5、10-6倍稀釋度懸液涂平板，每個稀釋度均做3個重復，在37 ℃條件下倒置培養2 d后計數；真菌培養采用孟加拉紅培養基，選擇10-1、10-2和10-3倍稀釋度懸液涂平板，每個稀釋度做3個重復，在28 ℃條件下倒置培養3～5 d后計數；放線菌培養采用改良高氏一號培養基，選擇10-3、10-4和10-5倍稀釋度懸液涂平板，每個稀釋度做3個重復，在30 ℃條件下倒置培養5～7 d后計數，并計算土壤中細菌和真菌數量的比值(B/F)，以反映土壤微生物區系結構；B/F比值降低，導致土壤土傳病害發生嚴重[12-13]。

1.2.2 土壤酶活性的測定

土壤過氧化氫酶和土壤脲酶活性分別采用Solarbio公司土壤過氧化氫(S-CAT)檢測試劑盒和Solarbio公司土壤脲酶(S-UE)檢測試劑盒測定。

1.2.3 土壤微生物高通量測序

土壤微生物分析采用新一代高通量測序技術(high-throughput sequencing)，這一技術又稱二代測序(next generation sequencing，NGS)或者平行測序(parallel sequencing)，可直接測序16S rRNA基因的PCR產物，每次分析獲得的基因序列數以百萬甚至億萬計，不僅通量高，而且能夠同時分析上百個不同的樣品，是解析復雜環境中微生物群落物種組成和相對豐度的重要工具，已經成為環境微生物多樣性檢測的首選[14-15]。Shannon-winner曲線是利用Shannon指數來進行繪制的，反映樣品中微生物多樣性的指數，利用各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性。

土壤微生物DNA提取采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒，分別用真菌和細菌通用引物進行PCR擴增，引物具體信息如表1所示，對擴增產物切膠回收檢測濃度后保存于-20 ℃用于后續的高通量測序。

2 結果與分析

2.1 輪間作處理對辣椒根際連作土壤微生物數量的影響

如表2所示，測試土壤中微生物群落中可培養的細菌數量最多，其次是放線菌，真菌數量最少，而且不同種植模式對土壤三大類群微生物數量有顯著的影響。不同種植模式土壤細菌數量變化為間作>輪作>連作；土壤真菌數量變化為連作>間作>輪作；土壤放線菌數量變化為輪作>間作>連作。與連作辣椒模式相比，大蒜-辣椒輪作以及玉米-辣椒間作能夠明顯增加土壤細菌數量，增幅分別為88.24%、112.61%；土壤放線菌數量分別增加302.81%、156.25%；土壤真菌數量分別減少51.74%、39.57%，差異達到顯著(P<0.05)水平。

此外，大蒜-辣椒輪作土壤中細菌和真菌數量的比值(B/F)最大，玉米-辣椒間作土壤次之，連作辣椒土壤最小，說明輪作和間作處理均能促進土壤細菌增殖而抑制真菌增殖，B/F值升高。以上結果表明，采用大蒜輪作和玉米間作能夠有效改善辣椒根際微生物區系，使根際微生物組成由真菌型向細菌型轉變。

表1PCR擴增產物

Table1Primers used for PCR amplification

表2 不同種植模式土壤三大類群微生物數量變化

Table2Dynamic of three major microbial number of different planting patterns

同列數據后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

The values in the same column followed by different letters showed significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 輪間作處理對連作辣椒根際土壤微生物結構的影響

2.2.1 輪間作處理對連作辣椒根際土壤微生物多樣性的影響

從表3的微生物多樣性Shannon指數中可以看出，各處理土壤細菌和真菌Shannon指數差異達到顯著水平(P<0.05)。與連作土壤相比，輪作和間作處理能夠顯著增加土壤細菌群落Shannon指數，增幅分別為6.84%、5.63%；同時分別顯著降低土壤真菌群落Shannon指數，降幅分別為13.06%、5.23%。

2.2.2 輪間作處理對辣椒根際連作土壤微生物群落組成的影響

如圖1所示，所有樣品中相對豐度大于1%的細菌按照其相對豐度的高低依次為(α-，β-，γ-，δ-)變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidete)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，其中(α-，β-，γ-，δ-)變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)為優勢種群，所有樣品中它們相對豐度分別為32%、23%；此外，所有樣品中真菌相對豐度從高到低依次為子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)，其中子囊菌門(Ascomycota)為優勢種群，占所有可測真菌群落的59%，是供試土壤樣品中主要的真菌類群。

表3 不同處理土壤細菌和真菌Shannon指數

Table3Shannon index of soil bacteria and fungi of different treatments

處理Treatment群落多樣性(Shannon指數)Shannon index細菌Bacteria真菌Fungi間作Intercropping12.296±0.057 b7.044±0.011 b輪作Rotation12.437±0.058 a6.462±0.012 c連作Continuous cropping11.641±0.050 c7.433±0.008 a

如圖2-A所示，不同處理土壤細菌群落中酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidete)、浮霉菌門(Planctomycetes)、黃單孢菌目(Xanthomonada)相對豐度差異較大。與連作3年相比，輪作和間作處理顯著提高了土壤酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度，增幅為27.91%、39.42%；同時提高了浮霉菌門(Planctomycetes)的相對豐度，增幅為61.22%、51.63%；但顯著降低了擬桿菌門(Bacteroidete)和黃單孢菌目(Xanthomonada)的相對豐度，以輪作處理效果最為顯著，降幅分別為71.78%、47.86%。圖2-B是不同處理土壤中相對豐度差異顯著(P<0.05)的三類真菌，雖然子囊菌門座囊菌綱(Dothideomycetes)和接合菌門(Zygomycota)相對豐度較低，但在不同處理土壤中相對豐度差異顯著。與連作3年土壤相比，輪間作處理顯著降低了子囊菌門座囊菌綱(Dothideomycetes)和鐮刀菌屬(Fusarium)的豐度，其中子囊菌門座囊菌綱(Dothideomycetes)的相對豐度分別減少56.36%、81.81%，鐮刀菌屬(Fusarium)的相對豐度分別減少46.77%、36.62%，但接合菌門(Zygomycota)相對豐度顯著增多，分別增加433.33%、283.33%。

由每個分類群條帶總數占測序條帶總數的比例繪制而成。The figure was drawn according to the percentage of number of each taxon bands in the total number of sequencing bands.圖1 細菌(A)和真菌(B)分類群組成Fig.1 Bacteria (A) and fungi (B) taxonomic group

同一種類不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars in the same type with different letters showed significant difference(P<0.05).圖2 不同處理土壤細菌和真菌相對豐度差異Fig.2 Differences between soil bacteria and fungi abundance of different treatments

2.3 輪間作處理對辣椒根際連作土壤酶活性的影響

如圖3所示，與連作土壤相比，玉米-辣椒間作和大蒜-辣椒輪作明顯增加了土壤過氧化氫酶活性，增幅分別為109.92%、122.31%，此外，輪間作處理也顯著提高了土壤脲酶活性，增幅分別為129.34%、93.67%，以輪作效果更為明顯，差異達到顯著(P<0.05)水平。

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars with different letters showed significant difference(P<0.05).圖3 不同處理土壤過氧化氫酶和脲酶活性Fig.3 Soil catalase and urease activity of different treatments

3 討論

大量研究表明，許多作物連作會導致土壤理化性狀變差、養分失衡等問題，而采用嫁接、施用微生物菌劑，以及合理的輪作、間作、填閑等栽培模式能夠提高土壤微生物種群多樣性和穩定性，緩解連作障礙，促進作物生長、增加產量。段曦等[16]采用嫁接的方式發現，嫁接辣椒根系分泌物組分變化是其減輕土傳病害的重要機理之一，砧木和嫁接辣椒降低辣椒發病率，產量分別比對照高31.7%和38.3%。祁紅英等[17]進行了幾種微生物菌劑對辣椒混合性土傳病害的田間防效試驗，發現微生物菌劑AR156-2處理增產率達214.39%。本研究采用輪作和間作等不同的栽培模式發現，大蒜-辣椒輪作和玉米-辣椒間作均顯著改善了連作辣椒土壤微生物區系和土壤酶活性，但其具體機理還有待進一步研究。

土壤微生物是土壤重要的組成部分，參與土壤中物質的分解與轉化，對土壤肥力的形成及其在植物營養的轉化中起著積極的作用。土壤微生物群落的多樣性和豐富度都與其生態環境相關[18]。在本實驗中，大蒜-辣椒輪作和玉米-辣椒間作處理后辣椒土壤微生物群落數量發生了顯著變化，輪間作處理較連作土壤細菌顯著增多，增幅分別為88.24%、112.61%，與此同時土壤放線菌數量增幅為302.81%、156.25%，真菌數量顯著減少51.74%、39.57%(表2)。楊鳳娟等[19]在黃瓜上的研究也得出了類似結果。高通量測序結果進一步表明，與連作土壤相比，輪間作處理細菌群落多樣性顯著增加，真菌相反(表3)。導致這一結果的原因可能是輪間作處理使土壤微生態環境及其可利用的營養發生了變化，從而使微生物群落結構發生改變。以上結果表明，輪間作處理使連作辣椒土壤微生物群落結構由“真菌型”向“細菌型”轉變。我們推測這種變化可能與輪間作處理改善了土壤微生態環境和土壤營養水平有關。

土壤微生物中細菌和真菌的種類和數量最多，其群落結構的改變與作物種類、土壤類型和養分、作物生長發育時期等密切相關。在細菌群落結構方面，已有研究表明，相比于馬鈴薯感病型土壤，酸桿菌門在抑病型土壤中豐度較高[20]；Sanguin等[21]在連續種植了10年小麥的抑病型土壤中發現很多屬于酸桿菌門、浮霉菌門的種群急劇增加，并指出這幾個門與土壤抑病功能密切相關；擬桿菌的分布與土壤營養水平呈顯著負相關[22]；黃單孢菌目部分細菌是植物病原菌，能夠引起辣椒細菌性瘡痂病。本實驗中，輪間作處理較連作土壤擬桿菌門(Bacteroidete)比例顯著降低，可能是與輪間作處理改善了土壤營養水平有關。此外，酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)相對豐度顯著升高，而黃單孢菌目(Xanthomonada)相對豐度顯著下降(圖2)，推測這可能是輪間作處理可以緩解辣椒土傳病害而連作土壤易發病的原因之一。在真菌群落結構方面，已有報道表明，作物土傳枯萎病病原菌的相對豐度與真菌接合菌門呈負相關關系，和真菌子囊菌門呈正相關關系[23]；許多病原菌均屬于子囊菌門，部分鐮刀菌屬是土壤根際潛在病原菌，可侵染植物維管束系統，破壞作物輸導組織維管束，導致作物萎蔫死亡；與甜瓜連作根際土壤相比，茴香輪作根際土壤中鐮刀菌屬略有下降趨勢[24]；引起果實煤污病的大多數病原菌屬于座囊菌綱[25-26]。本實驗中，輪間作處理土壤真菌的接合菌門(Zygomycota)相對豐度較連作土壤顯著升高，可能是由于接合菌能夠與高等植物共生形成菌根從而改良土壤微生態環境。此外，我們還發現輪間作處理較連作土壤子囊菌門座囊菌綱(Dothideomycetes)和鐮刀菌屬(Fusarium)相對豐度顯著降低，推測輪間作處理緩解連作障礙的原因可能與抑制此類病原菌的發生有關。

土壤酶參與有機質的分解和腐殖質的形成，是土壤生物活性的綜合表現，其催化土壤中的生物化學反應，影響土壤養分的形成和積累[27-28]。其中，過氧化氫酶主要來源于細菌、真菌以及植物根系的分泌物，它能破壞土壤中生化反應生成的過氧化氫，將過氧化氫分解為水和氧，減輕活性氧對植物的危害[29]。脲酶是一種對土壤有機態氮分解轉化起非常重要作用的酶，它直接參與尿素形態轉化，能夠催化尿素水解生成氨、水和二氧化碳，可以作為土壤生態系統變化的敏感指標，其活性反映土壤有機態氮向有效態氮的轉化能力和土壤無機氮的供應能力[30]。在本實驗中，與連作土壤相比，大蒜-辣椒輪作處理和玉米-辣椒間作處理之后，土壤過氧化氫酶活性和脲酶活性顯著升高(圖3)，推測輪間作栽培方式可能通過提高土壤過氧化氫酶和脲酶活性，促進土壤有機質轉化，進一步提高土壤供氮能力，改善因連作導致的土壤理化性質惡化的現象。這一結果與吳鳳芝等[5]和楊鳳娟等[19]在黃瓜設施蔬菜生產中輪間作能夠提高土壤過氧化氫酶、脲酶及相關酶活性的結果一致。

綜上所述，輪間作處理可能通過提高土壤酶活性、改善辣椒土壤微生物區系進而使得連作辣椒根際土壤得到一定程度的改良，但本實驗未直接測定輪間作處理對土壤理化性質和辣椒生長發育的影響，因此，輪間作處理緩解辣椒連作障礙的機制還有待進一步研究。