高通量測序法檢測奶牛乳房炎關聯微生物群落結構及多樣性

曾學琴，柳陳堅，楊 雪，李曉然

(昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500)

奶牛乳房炎是影響奶牛健康的主要疾病之一[1-2]，患病奶牛產奶量降低、乳品質下降，嚴重影響奶牛場的經濟效益和人類的食品安全[3-7]。研究發現，約150多種病原體可引起奶牛乳房炎[8]，這些病原體種類較為復雜，包含細菌、病毒、真菌、支原體等。常見的導致奶牛乳房炎的病原體有20多種，以細菌最為多見，其中金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌占所有病原菌的83.74%[9-10]。導致奶牛乳房炎的病原菌可分為2種：一種是病原微生物與乳腺接觸后定殖在乳腺；另一種是環境中的病原體，例如肺炎克雷伯菌、沙雷氏菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌[11]。研究顯示，25%的細菌引起的臨床乳房炎通常不能通過細菌培養檢測到[12]，因此僅僅采用微生物培養的方法并不能全面地反映樣品中的細菌狀況，需要使用分子生物學方法進行微生物群落結構分析。

目前治療奶牛乳房炎的主要方法是使用抗生素，但抗生素大劑量、高頻率的使用不僅會導致耐藥菌株的產生，而且容易造成抗生素在奶中殘留，從而危害人類健康。另外，金黃色葡萄球菌的菌株能產生內毒素，在飲用了含有此毒素的奶后，會引起嘔吐、發熱、脫水甚至休克等癥狀，危害食用者健康[13]。本研究選取乳房炎奶牛乳頭和牛奶進行采樣，并選取健康奶牛作為對照，基于Illumina MiSeq高通量測序技術研究樣品中的微生物多樣性，確定引起奶牛乳房炎的主要病原菌，通過乳頭擦拭樣品與牛奶樣品微生物組成的比較，對引起奶牛乳房炎的病原菌進行溯源，為奶牛乳房炎的控制提供前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Sigma3-18K離心機，美國Sigma公司；Labnet 230VEU渦旋儀，美國Labnet公司；ABI 7200 PCR儀，美國ABI公司；Nanodrop ND 1000分光光度計，美國Thermo公司。PCR Master Mix，北京TIANGEN公司；QIAquick Gel Extraction Kit，德國Qiangen公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及預處理

到云南東南部的紅河哈尼族彝族自治州瀘西縣牧場采集患乳房炎奶牛和正常奶牛的乳頭擦拭樣品和牛奶樣品。擦拭樣品采集時，用無菌棉簽蘸少量滅菌的生理鹽水后進行擦拭，并將擦拭后的棉簽置于無菌管中；用無菌棉簽蘸少量滅菌的生理鹽水擦拭乳頭后，將牛奶擠入無菌管中。共采集乳房炎奶牛的乳頭擦拭樣品9個(MN1-MN9)、牛奶樣品5個(NM5-NM9)，正常奶牛乳頭擦拭樣品(HN1、HN2)和牛奶樣品(NH1、NH2)各2個，共18個。將所有樣品低溫保存并盡快運至實驗室保存于-80℃冰箱，用于后續DNA提取。

1.2.2 DNA提取和16S rRNA基因擴增及高通量測序

DNA提取參考文獻[14]的方法并做適當的修改。使用細菌的16S rRNA基因V4-V5高變區通用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和909R(5’-TTTCAGYCTTGCGRCCGTAC-3’)，在引物5’末端添加測序所需接頭。PCR擴增體系中，DNA模板添加量為15 ng。擴增產物經分光光度計定量后，使用Illumina MiSeq測序系統對DNA進行測序。

1.2.3 分類信息分析

分析測序文件，去掉測序質量不好的序列，并對序列長度進行篩選，刪掉長度小于400 bp的序列，得到有效的序列文件。使用Mothur Version 1.39.1軟件包[15]的Miseq SOP程序進行分析，經過去除Chimera后對序列進行分類信息分析，Threshold參數為80，數據庫的序列和分類信息來源為SILVA SSURef database v128[16]。

1.2.4 可操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)和系統發育樹分析

按照序列相似度為97%劃分OTUs，統計每個OTU的序列數目，序列比例大于10%的OTU將用于后續分析。從每個OTU中選取代表序列，將其與NCBI的GenBank數據庫進行Blast比對，選取有分類信息的參考序列進行比對[17]，利用Mega 5.0[18]中的Neighbour-joining[19]構建系統進化樹，Bootstrap值為1 000。對所有樣品的序列數目進行均一化處理，取序列數目的對數值后，使用HemI 1.0軟件繪制熱圖。

1.2.5 多樣性指數分析

統計只有1條序列的OTU，覆蓋度計算公式如下：

C=[1-(n1/N)]×100。

(1)

式(1)中，n1代表只有1條序列的OTU數，N則表示總序列數。對所有序列與數據庫序列進行比對，計算所有序列之間的差異，Cutoff值為0.03。將輸出的距離矩陣文件使用Cluster命令進行聚類，繼而使用rarefaction.single命令分別計算各個樣品的OTU數目、Chao1和ACE指數。

1.2.6 樣品聚類分析

使用Thetayc算法對所有樣品的序列計算距離矩陣和聚類，并進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 樣品測序結果及多樣性指數

通過16S rRNA基因序列測序，分析樣品中的微生物群落多樣性。對樣品原始序列條帶中低質量條帶進行過濾，并進行去冗余處理，所得到的序列數及多樣性指數如表1所示。奶牛乳頭擦拭樣品中的OTU數目和微生物多樣性普遍高于牛奶樣品，患病奶牛乳頭擦拭樣品中的OTU數目和微生物多樣性高于正常奶牛，而牛奶樣品中的OTU數目和微生物多樣性低于正常奶牛。

樣品中細菌的稀釋曲線(rarefaction curve)如圖1所示。稀釋曲線反映了樣品的取樣深度，可以用來評價測序量是否足以覆蓋所有類群。所有樣品的稀釋曲線已趨于平緩，說明樣本的OTU覆蓋度已基本飽和，測序數據量合理。

2.2 微生物群落的多樣性分析

2.2.1 細菌門分類水平的比較

利用QIIME軟件分析各樣品在門分類水平上菌群的組成和結果(圖2)，共得到10種細菌類群。乳頭擦拭樣品與牛奶樣品中，優勢細菌類群及其所占比例不同。乳房擦拭樣品中的優勢細菌類群依次是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，各個樣品均含有這4種細菌類群，但各個細菌類群在樣品中的占比差異較大。其中，樣品MN1中豐度最高的細菌類群是梭桿菌門(Fusobacteria，42%)；牛奶樣品中豐度最高的細菌類群是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)；樣品NM9中豐度最高的細菌類群是厚壁菌門(Firmicutes)，其次是變形菌門(Proteobacteria)；其他6個樣品豐度最高的是變形菌門(Proteobacteria)，且該細菌類群在樣品中所占比例極高。

表1 樣品的序列信息及多樣性指數

Table1Sequence information and its diversity indexs of samples

樣品來源Sources樣品Samples序列數Number of sequencesOTU數Number of OTUsChao1ACE覆蓋度Coverage/%乳腺炎奶牛乳頭MN1119706101706304097Mastitis cows nipplesMN296828081773254597MN3121138202078282996MN41765910992088295597MN54888516713495374999MN64476433355841719897MN74613015233317385299MN84376332495594700297MN94299631735354638197正常高產奶牛乳頭HN1188228092216347697Nipples of normal high-yield cowHN21545513382405281196乳腺炎奶牛牛奶NM5228254571154134199Mastitis cows milkNM62814714542377283298NM7256539971905238598NM8185959802002253697NM92776215804155316197正常高產奶牛牛奶NH12522720973792455396Milk of normal high-yielding cowNH2307834561034112399

圖1 相似度為97%條件下各樣本的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of each sample at cutoff level of 3%

2.2.2 細菌科分類水平的比較

利用QIIME軟件分析各樣品在科分類水平上菌群的組成和結果(圖3)。研究發現，不同樣品來源間細菌類群差異較大。乳房炎擦拭樣品均含有且豐度較高的是Moraxellaceae、Ruminococcaceae、Xanthomonadaceae、Staphylococcaceae，不同癥狀的各個樣品之間細菌類群的組成和比例明顯不同。樣品MN1細菌組成與其他樣品差異最大，優勢細菌類群有Fusobacteriaceae、Leptotrichiaceae、Bacteroidaceae；MN2、MN3、MN4細菌類群多樣性豐富，組成大致相同；MN5、MN6、MN7、MN8、MN9細菌組成大致相同。2個正常高產奶牛擦拭樣品中優勢細菌類群不同，HN1主要是Moraxellaceae(24%)，HN2主要是Ruminococcaceae(19%)。牛奶樣品中豐度最高的是Pseudomonadaceae，尤其在樣品NH2中高達88%，但樣品NM9中豐度最高的是Enterococcaceae(24%)。

圖2 細菌門分類水平的比較Fig.2 Comparison of bacteria groups at phylum level

圖3 細菌科分類水平的比較Fig.3 Comparison of bacteria groups at family level

2.2.3 細菌屬分類水平的比較

利用QIIME軟件分析各樣品在屬分類水平上菌群的組成和結果(圖4、圖5)，乳房擦拭樣品與牛奶樣品明顯不同，乳房擦拭樣品不同癥狀的各個樣品之間差異較大。乳房擦拭樣品除MN1外均檢測到且比例較高的屬為Acinetobacter，樣品MN1中比例較高的是Fusobacterium(29%)和Caviibacter(13%)。牛奶樣品除NM9外，豐度最高的是Pseudomonas(55%)，其次是Pseudomonadaceae_unclassified(16%)。此外，樣品NM9檢測到了較大比例的Enterococcus(33%)，且該屬僅在NM9中被檢測到。

2.3 OTU數及系統發育分析

將豐度較高的14個OTU序列抽提出來，在NCBI的GenBank進行Blast比對，下載最相近的序列構建系統發育樹(圖6)，將14個OTU在樣品中的數目均一化后取對數值繪制熱圖(圖7)。

圖4 乳房擦拭樣品細菌屬分類水平的比較Fig.4 Comparison of bacteria groups at family level of breast wipe samples

圖5 牛奶樣品細菌屬分類水平的比較Fig.5 Comparison of bacteria groups at genus level of milk samples

圖6 聚類分析圖Fig.6 Cluster analysis diagram

圖7 熱圖Fig.7 Heat map

乳房擦拭樣品和牛奶樣品中的主要OTU存在在較大差異。所有乳房擦拭樣品均含有OTU00017，被鑒定為Pseudomonasstutzeri。MN1豐度最高的是OTU00014，與Fusobacteriumnecrophorum相似度極高。MN2豐度最高的是OTU00011，與Janibacter屬中的Janibactercremeusstrain RSB8一致。MN3、MN5、MN6、MN8、MN9、HN1豐度最高的均為OTU00002，屬于Acinetobacter，與Acinetobactersp.993B6_12ER2A序列最為接近。MN4最高的是OTU00016，與Atopostipessp.strain ZH16相似；其次是OTU00011。MN7最高的是OTU00006，其屬于Fusobacteria。HN2最高的是OTU00004，被鑒定為Achromobacterxylosoxidans。NM5、NM6、NM7、NM8、NH1、NH2豐度最高的均為OTU00001，OTU00001屬于Pseudomonas，與Pseudomonassp. ps1-11的序列極為相似。NM9豐度最高的則為OTU00003，OTU00003與Vagococcussp. 176B7_12Agalle相似；其次是OTU00005，其與Jeotgalibacadankookensisstrain HM序列相似。OTU00008存在于所有樣品中，被鑒定為Corynebacteriumfaecale。最值得注意的是，OTU00020存在于所有乳房炎奶牛的樣品中，該OTU被鑒定為Staphylococcusaureus。

2.4 聚類分析

對18個樣品進行聚類分析(圖8)。乳頭擦拭樣品和牛奶樣品的微生物明顯分開，乳房炎奶牛的乳頭擦拭樣品除MN1外都聚在一起，正常奶牛的乳頭擦拭樣品聚在一起，乳房炎奶牛的牛奶樣品除NM9外都聚在一起，正常奶牛的牛奶樣品聚在一起。

圖8 基于Thetayc算法的聚類分析Fig.8 Cluster analysis based on Thetayc calculator

3 討論

奶牛患乳房炎不僅會造成重大經濟損失，還會危害人類健康。本研究使用基于16S rRNA基因的高通量測序技術對患乳房炎奶牛和正常奶牛的乳頭擦拭樣品、牛奶樣品的微生物多樣性進行分析，探索奶牛患乳房炎后乳房表面和乳房內微生物組成和變化。

Catozzi等[20]的研究表明，乳房炎奶牛牛奶樣品中主要存在厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，與本研究的結果不完全一致。已有研究發現，梭桿菌(Fusobacteria)在結腸癌細胞中生長旺盛，并且與結腸炎相關[21-22]；Swidsinski等[23]的研究認為，梭桿菌門(Fusobacteria)中的各種梭菌都與急性闌尾炎有關。本研究結果顯示，在癥狀嚴重的3個樣品中，梭桿菌門(Fusobacteria)豐度較高，表明其與奶牛乳房炎的發生密切相關。

莫拉氏菌科(Moraxellaceae)主要包括莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)及相關生物體。其中，不動桿菌(Acinetobacter)是條件致病菌，在自然界分布廣泛(如水、土壤、蔬菜等)[24]。本研究中，莫拉氏菌科(Moraxellaceae)細菌在患病奶牛樣品中的豐度普遍高于正常奶牛，不動桿菌豐度變化趨勢與莫拉氏菌科豐度變化一致，說明主要是不動桿菌發揮作用。在牧場中，來自于自然界的不動桿菌容易在奶牛潮濕的乳房部位形成菌群，造成乳房感染后引發乳房炎，不動桿菌可能是造成乳房炎的外源病原菌。假單胞菌科(Pseudomonadaceae)中的假單胞菌(Pseudomonas)是機會致病菌，與壞死病變有關[25-26]。擠奶易造成奶牛乳房機械性損傷，假單胞菌屬豐度的改變存在兩種可能：一種是奶牛患乳房炎后免疫力下降、接受抗生素治療引起假單胞菌屬感染；另一種可能是自然界中的假單胞菌通過乳頭進入乳房并定植于乳房內，使得乳房內假單胞菌含量升高，定植于乳房內的假單胞菌引起奶牛乳房炎。假單胞菌可能是造成乳房炎的內源致病菌。葡萄球菌科(Staphylococcaceae)中的葡萄球菌(Staphylococcus)多為致病菌，本項研究中，病牛乳頭擦拭樣品中均含有葡萄球菌，且患病奶牛中的含量明顯高于正常奶牛。

各個樣品中的主要OTU存在較大差異。所有擦拭樣品中都含有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，OTU00020)，金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎病例中經常分離到的病原體[27]。MN3、MN5、MN6、MN8、MN9中分離的主要是不動桿菌屬(Acinetobactersp.，OTU00002)，不動桿菌屬的細菌多為條件致病菌[24]。MN1中豐度最高的是壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum，OTU00014)，壞死梭桿菌屬于梭菌屬，梭菌屬細菌與多種疾病的發生具有相關性[21-23]，且壞死梭桿菌是多種壞死病的主要或次要病原菌[28]。牛奶樣品中主要含有假單胞菌屬(Pseudomonassp.，OTU00001)細菌，假單胞菌屬是機會致病菌，但其在正常牛奶樣品中也大量存在，與乳腺炎的相關性還需擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，奶牛乳房表面與牛奶中的微生物差異極大，牛奶中的微生物更能代表整個乳房的微生物組成，奶牛患乳房炎后乳房表面和乳房內微生物組成都會發生變化，外源病原菌和內源病原菌都可能引起乳房炎。