四株豬偽狂犬病毒株的分離鑒定與主要毒力基因分析

易可可，陰文奇，周遠成，蔣金蓁，張白玉，李中銀，顏其貴，*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130；2.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066；3.四川華神獸用生物制品有限公司，四川 成都 610200；4.四川伊禾動物藥品有限公司，四川 成都 610066)

豬偽狂犬病(porcine pseudorabies，PR)是由豬偽狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)引起的一種由皰疹病毒感染的高度接觸性傳染病[1-2]，能引起豬發熱、奇癢、繁殖障礙、腦脊髓炎等癥狀。PRV能感染反芻動物、嚙齒動物、食肉動物等哺乳動物和鳥類，有高致病率[3-5]，但豬是PRV唯一的傳播和貯存宿主[6]，能隱性感染，長期帶毒，曾經給歐洲和美洲帶來巨大經濟影響[7-10]。PRV主要侵害豬神經系統及生殖系統，各個階段豬只均可感染，可引起妊娠母豬繁殖障礙病毒終身潛伏、流產、產死胎和呼吸道癥狀；新生仔豬出現神經癥狀、腹瀉、嘔吐、生長不良等表現，死亡率極高[11]，一旦感染該病，難以清除[12]，其傳播速度快、范圍廣、途徑多，國際動物衛生組織(OIE)已將其列為二類傳染病[6]。20世紀gE基因缺失的Bartha-K61疫苗傳入中國，從90年代開始廣泛應用于我國的各大豬場，使PRV得到了有效的控制[13]。2011年以來，許多接種了Bartha-K61疫苗的豬場大規模暴發PRV，對我國養豬業和農業經濟造成了巨大損失，通過近年來的分離毒株分析，PRV變異是暴發偽狂犬病的最主要原因[14-15]。由此可見，Bartha-K61疫苗不能對變異PRV毒株起到全面和有效保護作用[16]。

本實驗從2016—2017年疑似感染偽狂犬病的豬病料中分離出4株PRV毒株，通過生物學特性研究分析，并收集2011年至今的主要變異毒株和國內外經典毒株進行毒力基因gB、gC、gE和TK序列比對，進行同源性測定并構建進化樹，分析變異株的基因間差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與實驗動物

從福建和四川某豬場疑似PRV感染仔豬中分別采集腦、扁桃體、肺臟、脾臟等組織，-20 ℃保存備用。6周齡Balb/c小白鼠購于成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.2 主要試劑

DMEM細胞培養液、胰酶購自Hyclone公司，胎牛血清購自AusGeneX公司；LATaq聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體、GC Buffer、dNTP、大腸埃希菌DH5α感受態細胞購自寶生物工程(大連)有限公司；血液/組織/細胞基因組提取試劑盒購自TIANGEN生化科技有限公司；膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自OMEGA公司；豬腎細胞(PK-15細胞)由四川農業大學微生物與免疫實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 病豬的病理解剖與病料處理

對采集的病豬病變組織進行研磨，加入適量PBS制成勻漿，反復凍融3次，10 000g離心5 min，將上清液分裝置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 引物設計與合成

根據GenBank中發表的PRVgB、gC、gE、TK(登錄號為KM189912.1)全基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計gE檢測引物和4對引物擴增該4個基因的全長，引物序列見表1，引物由成都擎科有限公司合成。

1.2.3 病毒DNA的提取

對采集的組織病料提取DNA，使用TIANGEN的血液/組織/細胞基因組提取試劑盒，具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.4 病料PCR鑒定

以提取的病料DNA作為模板，反應體系為25 μL，LATaq酶0.25 μL，2×GC Buffer Ⅰ/Ⅱ 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，dNTP 1 μL，滅菌去離子水補足25 μL。鑒定PRVgE基因反應條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，61.4 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，溫度降至4 ℃，加入2.5 μL 10×Loading Buffer終止反應；取10.0 μL PCR產物加入1.0%瓊脂糖膠孔中電泳，于凝膠成像系統下觀察結果并拍照。

表1 引物序列信息

Table1Primer sequence information

引物名稱Primer name引物序列Sequence(5′-3′)長度Length/bp退火溫度Annealing temperature/℃GC Buffer引物用途UsagePgE-FACCTGAGCGTCCTGCGG55361.4Buffer Ⅰ鑒定PRV Identification of PRVPgE-RCCGTTGTGGGTCATCACGAGgB-FTCTTCAGGTCCGTCTTCCAC287751.0Buffer ⅡgB基因 gB genegB-RAACGGCATCTTTATTTTTTTCCATCTgC-FTGTGTGCCACTAGCATTAAATCCG170255.0Buffer ⅠgC基因gC genegC-RGAGAGGAGAGTGGAGTGGGACgE-FGCCACCATCGCAGAAGAACAA205756.0Buffer ⅡgE基因gE genegE-RTCTCGCTGTAGTAGCAGTCCGTK-FATGCGCATCCTCCGGATCTACCTCG96362.0Buffer ⅠTK基因TK geneTK-RTCACACCCCCATCTCCGACGTGAAG

1.2.5 病毒分離培養

將PCR鑒定為陽性的PRV病料處理成懸液，4 ℃ 4 000 r·min-1離心10 min，取上清液用0.22 μm過濾器過濾后，加適量雙抗孵育過夜，保存至-20 ℃。待PK-15細胞長成單層鋪至80%時，取1 mL濾液接種細胞，輕輕混勻，37 ℃ 5% CO2培養箱中放置1 h，倒去濾液加入2% DMEM維持液，同時設立對照細胞組，每天觀察細胞狀況，并記錄病變情況，待病變達到70%時收毒，盲傳5代后進行PCR鑒定。

1.2.6 病毒TCID50測定

將收集的病毒液反復凍融3次，12 000 r·min-1離心1 min，取上清液。PK-15細胞在96孔中培養至單層，將分離的病毒液用DMEM培養液按10倍梯度稀釋，從10-1～10-10，按照每個稀釋度分別加1列8孔，每孔加入100 μL，最后兩列只加入DMEM培養液作陰性對照，置于細胞培養箱放1 h后吸去每孔中的液體，用PBS洗兩次后加入100 μL 2% DMEM培養液，繼續培養，72 h后開始觀察并每天記錄病變孔數情況，按Reed-Muench法計算病毒TCID50。

1.2.7 小鼠LD50測定

每株準備50只6周齡雌性SPF級Balb/c小鼠，隨機分成5組，每組10只。將病毒10倍梯度稀釋成104～100TCID50s，每個稀釋度一組，接種0.1 mL于小鼠大腿肌肉；同時設立一組空白對照，相同劑量和部位注射DMEM培養液，在相同條件下隔離飼養。每6 h觀察并記錄小鼠精神狀況、臨床癥狀和死亡時間，結果根據Reed-Muench法計算病毒對Balb/c小鼠的半數致死量(LD50)。

1.2.8gB、gC、gE和TK全基因測序

病毒液抽提DNA后作為模板，反應體系為50 μL，LATaq酶0.5 μL，2×GC Buffer Ⅰ/Ⅱ 25 μL，上下游引物各2 μL，模板2 μL，dNTP 4 μL(根據目的條帶長度添加，每1 000 bp添加1 μL)，滅菌去離子水補足50 μL。94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，51 ℃(根據不同引物選擇退火溫度)1 min，72 ℃ 1 min(根據目的條帶大小選擇，每1 000 bp延長1 min)，35個循環；72 ℃延伸10 min，溫度降至4 ℃，PCR產物加入1.0%瓊脂糖膠孔中電泳，回收目的片段，連接pMD18-T載體轉入大腸埃希菌DH5α感受態細胞，在LB氨芐固體培養基上篩選出陽性菌后，提取質粒，送往成都擎科生物有限公司測序。

1.2.9 毒力基因全基因序列分析

參考多株國內外經典和變異PRV毒株，利用Mega7.0和MegAlign軟件將測序結果的gB、gC、gE和TK基因序列進行對比和建立進化樹。

2 結果與分析

2.1 PRV的分離鑒定

2.1.1 病理剖檢結果

患病仔豬剖檢后發現所有仔豬均出現腦出血，扁桃體壞死，肺臟和腎臟有出血點，肝臟和肺臟表面有白色壞死灶等癥狀。

2.1.2 病料檢測結果

病料組織進行gE基因PCR擴增后，在檢測的腦部、扁桃體、腎臟、肺臟等均擴增出553 bp的目的條帶。

2.1.3 病毒的分離

處理的組織懸液接種到長滿單層的PK-15細胞上，第1代均出現病變，盲傳幾代后時間和CPE穩定，接毒后24 h后細胞變圓變亮，聚集，拉網并形成合胞體(圖1-A)，而對照組沒有病變(圖1-B)。

2.1.4 病毒液的PCR鑒定

對病毒液提取的核酸進行PRVgEPCR鑒定，結果能擴增出目的條帶(圖2)。

2.1.5 病毒滴度測定

病毒在PK-15細胞上傳第1代和第5代的都收毒進行滴度測定，按照Reed-Muench法計算PRV的滴度，單位為每0.1 mL病毒液中含多少TCID50s的病毒粒子，結果如表2。

2.1.6 小鼠LD50測定

PRV FJ01株、FJ03株、YK株和MS2018株分別攻毒Balb/c小鼠后，臨床癥狀為局部嚴重瘙癢、呼吸急促、被毛蓬亂、頻繁舔咬注射部位并裸露出皮膚，死亡時間平均為54～96 h，高劑量小鼠全部死亡，對照組小鼠精神狀態正常。PRV各毒株對Balb/c小鼠的半數致死量LD50分別為102.17、102.72、103.44、103.51TCID50s(表3)。

A，PRV感染細胞；B，正常細胞對照。A， Virus infected cell; B， Normal cell control.圖1 病料懸液上清液感染PK-15細胞病變圖(100×)Fig.1 Cytopathic effect of PK-15 cells infected by epidemic tissue suspension supernatant (100×)

表2 不同代次PRV毒株滴度測定

Table2Titers identification of different passage PRV strains

毒株Strain滴度Titers/(TCID50s·0.1 mL-1)F1F5FJ0110-6.310-6.63FJ0310-6.610-7.08YK10-7.710-8.10MS201810-6.710-7.18

2.2 PRV分離株的gB、gC、gE和TK基因的序列分析

2.2.1gB基因

PRV FJ01株、PRV FJ03株、PRV YK株和PRV MS2018株的gB基因核苷酸序列與2011年以來國內流行的PRV變異株HNB、ZJ01、JS-2012、TJ株等的同源性為98.5%～100%，與疫苗株Ea、Fa和Bartha株同源性為98.2%～99.8%，與國內外PRV經典毒株Kaplan、Kolchis、NIA3、Becker等同源性為97.7%～99.6%；4個分離PRV毒株的gB基因編碼的氨基酸與近年流行的變異株同源性為97.0%～100%，與疫苗株同源性為96.3%～99.7%，與經典毒株同源性為95.3%～99.1%。PRV FJ01、FJ03和MS2018株在進化樹上與近幾年國內分離的PRV變異株HN1201、HNX、HNB等在同一大分支；YK株與國外經典毒株親緣性更近(圖3-A)。

表3PRV毒株對Bablb/c小鼠LD50測定

Table3LD50measurement of PRV strains on Balb/c mice

毒株Strain分組Group感染劑量Dose/TCID50s小鼠數量Mice number死亡數Mortality存活數Survival number半數致死量LD50/TCID50sFJ01A410410100102.17A310310100A21021046A110110010A010010010FJ03B41041091102.72B31031073B21021019B110110010B010010010MS2018C41041073103.51C31031028C21021019C110110010C010010010YKD41041082103.44D31031028D21021019D110110010D010010010對照組ControlEPK1510010—

“—”表示無數據。

“—” represented no data.

圖3 PRV分離株gB、gC基因的核苷酸遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of PRV gB and gC gene between PRV strains and other reference strains

2.2.2gC基因

PRV FJ01株、FJ03株和MS2018株gC基因的核苷酸序列與近年流行變異PRV株同源性為91.8%～99.9%，與Ea、Fa、Bartha和SA215疫苗株同源性為91.9%～99.9%，與國內外經典毒株同源性為89.3%～98.7%，同源性較低；gC基因編碼的氨基酸與變異毒株，除YK株外同源性為97.0%～100%，YK株為89.5%～89.7%，同源性較低；與PRV疫苗株同源性為88.4%～99.4%，與國內外經典毒株同源性為86.0%～96.9%。在進化分支上，PRV FJ01株、FJ03株、MS2018株與國內毒株親緣性更近，與近年的變異株在同一大進化分支上，而YK株與國外經典毒株在同一進化分支上，與國內毒株親緣性遠(圖3-B)。

2.2.3gE基因

PRV FJ01株、F0J3株和MS2018株gE基因的核苷酸序列與近年流行變異PRV株同源性為95.9%～99.5%，與Ea、Fa、Bartha疫苗株的同源性為96.4%～99.5%，與Kaplan、Becker、Kolchis、Hercules等國外經典毒株同源性為96.1%～98.8%；gE基因編碼的氨基酸與近年變異PRV株同源性為90.6%～100%；與疫苗毒株同源性為95.8%～99.4%，與國外經典毒株同源性為95.6%～100%。FJ01株、FJ03株、MS2018株在進化樹上與國內2011年后分離出的PRV毒株如HNX株、HLJ8株、HB1201株、HN1201株等在同一大進化分支上，與疫苗毒株和國內外經典毒株親緣性較遠；YK株與國外經典毒株在同一進化分支上，親緣性較近(圖4-A)。

2.2.4TK基因

4個分離PRV毒株的TK基因核苷酸序列與國內近幾年流行分離HNX、JS-1201、HB1201、BJ/YT等變異毒株同源性為98.4%～100%，與Bartha、Fa、Ea等疫苗株同源性為98.6%～100%，與國外經典毒株Kaplan、Becker等同源性在97.9%～99.7%，各毒株間遺傳變異不大，同源性都很高，說明TK基因較為保守。TK編碼的氨基酸序列與近年變異株同源性為99.7%～100%，與疫苗株同源性為99.0%～99.9%，與國外經典毒株同源性為98.3%～99.9%，同源性較高。FJ01株、FJ03株與MS2018株的TK基因序列在進化樹上與國內分離的各PRV毒株在同一進化分支上，與國內毒株親緣性較近；YK株的TK基因與國內和國外均親緣性較遠，在單獨一個分支上(圖4-B)。

3 討論

自2011年以來，中國許多地區免疫過Bartha-K61疫苗的豬場大規模暴發PRV[17]，且在國內廣泛流行，有研究已經確定了是由PRV變異毒株引起[18]，意味著Bartha-K61疫苗已不能全面提供保護[19]，疑似暴發PRV豬場的豬表現為高燒、嚴重呼吸道疾病、厭食、震顫等精神癥狀[18]。本研究對各地豬場有疑似PRV的病料進行抗原檢測和病毒分離，得到4株PRV病毒，初步鑒定為野毒感染，并深入研究是否為變異毒株以及生物學特性探究。

圖4 PRV分離株gE、TK基因的核苷酸遺傳進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of PRV gE and TK gene between PRV strains and other reference strains

本實驗采用豬腎PK-15細胞分離病毒，4個病毒分別命名為PRV FJ01株、PRV FJ03株、PRV YK株和PRV MS2018株。將病毒盲傳至5代，同時與第一代病毒做TCID50，發現滴度隨著代數增多而增加。用第5代毒攻毒Balb/c小鼠計算半數致死量，毒力最強的毒株為PRV FJ01株，LD50為102.17TCID50s·0.1mL-1，而我國在2011年前就分離得到的Fa、Ea和S經典毒株LD50分別是100.7、102.0和103.83TCID50s，2011年后分離出的HNX、HNB、TJ、HeN1和JS-2012株的LD50分別為102.0、102.4、102.3、102.37和102.37TCID50s，可以看出Fa毒力是最高的，由此可以得知，中國變異株的毒力沒有增強，豬群暴發偽狂犬病且高死亡率與毒力增強無關，但從小鼠實驗結果可以發現，變異株能讓小鼠產生更為嚴重的瘙癢癥狀。

gB是PRV必需糖蛋白，也是主要的免疫相關蛋白，是最保守的蛋白之一，是病毒感染所必需的，與病毒入侵細胞和在細胞間傳播密切相關[20]，產生中和病毒的抗體[21]。gC參與病毒入侵細胞過程，是PRV最主要的保護性抗原之一，能誘導細胞免疫，產生中和抗體[19]，gB和gC的變異性，是偽狂犬病毒的特征；gE不是病毒復制必需的蛋白，但它是主要的毒力因子之一，呈現出嗜神經性，在病毒釋放與傳播中使PRV接觸臨近的神經元，從而進入中樞神經系統，促進病毒在內轉運和擴散[22]，有研究表明，gE缺失株與其他蛋白缺失株相比親神經性更弱，因此gE可能在侵蝕和傳播神經系統中有更重要的作用[23]。TK也是主要毒力基因，與建立和激活神經潛伏狀態，在中樞神經中增殖有關[24]，當缺失TK時，病毒增殖不受到影響，但毒力和侵染力大幅度降低[25]，因此在基因缺失苗研發中常使用缺失TK的PRV毒株。通過gB、gC、gE和TK全基因的遺傳進化分析建立進化樹，PRV FJ01株、PRV FJ03株和PRV MS2018株與2011年后分離的變異株親緣性相近，而YK株與國外毒株在同一進化分支上，與國內毒株親緣性較遠。4株分離PRV的gB核苷酸序列與國內外PRV參考株的同源性為97.7%～100%；gC核苷酸序列與國內外PRV的同源性為89.3%～99.9%；gE與國內外PRV的核苷酸同源性為96.1%～99.8%；TK基因與國內外PRV的核苷酸同源性為97.9%～100%。分析各個毒株分別與2011年至今流行的PRV的毒力基因同源性，發現同源性較高，說明2011后的流行毒株間變異較小。

通過分離出來的4個毒株與國內市面上主要流通的疫苗毒株如Bartha-K61株和SA215株進行基因序列比對有一些變異，雖然目前流行病學數據顯示我國豬場加強疫苗免疫可以大部分防控PRV，但不能完全清除，這與我國還有許多散戶，養殖環境等有關，這可能也是PRV仍在流行變異的原因之一[26]。為了防控新變異PRV，以近年流行的PRV為親本研發新型疫苗可能對豬起免疫保護作用更加有效；且隨著全基因組測序的普及，關于PRV遺傳變異的研究越來越多，數據庫越來越大，發現PRV雖然GC含量高，結構穩定，但仍出現變異，YK毒株分離于近年感染偽狂犬病的病料，其免疫原性基因gB、gC和gE與國外毒株相近，TK在進化樹上位于獨立分支上，TK毒株是否出現基因重組，需要從全基因組角度來進行進一步探究。