一個新的磷轉運蛋白ClPHT4;2的高表達是 西瓜瓤色發育的必要條件

張潔 郭紹貴 任毅 張海英 宮國義 周明 王貴章 宗梅 何洪巨 劉凡 許勇

目的與意義：果實瓤色變化是西瓜果實成熟的重要標志。西瓜果肉細胞中的有色體不斷發育并積累各種類胡蘿卜素物質導致了西瓜果實瓤色的出現。前人的研究著重于分析在類胡蘿卜素合成途徑中各種重要酶類的變化對瓤色的影響，而對于作為類胡蘿卜素代謝途徑載體的有色體的發育過程的解析不足。我們著重分析了不同瓤色西瓜中有色體的發育過程的異同，并發現了保障其正常運轉的重要轉運蛋白。其中一類磷轉運蛋白（PHT）在模式作物擬南芥的研究中表明，其對維持葉綠體、淀粉體等質體的代謝反應起到舉足輕重的作用，但PHT在有色體中的作用與功能尚無報道?；谖鞴喜煌l育時期轉錄組測序數據，我們在西瓜中首次發現一個在果實中特異表達的基因PHT類基因，該基因在紅瓤和白瓤西瓜中的表達量和轉錄調控區序列存在顯著差異，因此，我們極為關注該基因的功能及其蛋白表達及轉錄調控是否最終影響有色體的發育，從而影響西瓜瓤色形成。

材料與方法：選取西瓜試驗材料為東亞類型的紅瓤栽培品種‘97103（Citrullus lanatus subsp. vulgaris East-Asia Ecotype）和近緣白瓤野生種‘PI296341-FR（Citrullus lanatus subsp. lanatus）。通過透射電鏡觀察西瓜果肉細胞的亞細胞結構中有色體的發育及成熟過程。通過密度梯度離心法提取西瓜果實完整有色體。提取不同果實不同發育階段的RNA，進行果實轉錄組測序（美國康奈爾大學費章軍教授合作完成）。通過互補酵母磷轉運缺陷株驗證其磷轉運蛋白的功能。制作了該蛋白的特異抗體，通過免疫膠體金亞細胞定位結合果肉細胞原生質體轉化等方法確定候選蛋白的表達部位。通過對該基因序列及表達水平的差異分析，發現特異的順式調控元件，利用酵母單雜交體系進行候選轉錄因子的篩庫試驗。結合EMSA試驗及煙草葉片瞬時轉化試驗，檢測候選轉錄因子與啟動子的結合能力。同時還試驗了糖分、ABA、乙烯及其抑制劑處理對西瓜瓤色發育的影響。

結果與分析：首先分析了紅瓤材料‘97103與白瓤材料‘PI296341-FR在果瓤細胞發育中的差異。通過透射電鏡觀察發現，在紅瓤材料中細胞中有更多的前質體發育為有色體，且在有色體中大量積累了類胡蘿卜素類物質。而白瓤果實中的有色體發育少，且其中只積累了為數不多的類胡蘿卜素色球。此外研究還發現，紅瓤西瓜果瓤細胞中的有色體質膜在有色體發育過程中變化明顯。在深入了解西瓜有色體發育的基礎上，通過反向遺傳學分析發現了一個在果實中特異表達的磷轉運蛋白基因ClPHT4;2（基因編號：Cla017962），其表達情況與紅瓤西瓜有色體發育過程一致，且通過酵母磷轉運缺陷株驗證了其磷轉運蛋白的功能。進一步通過免疫膠體金及熒光共定位分析發現，ClPHT4;2蛋白確實定位在有色體質膜上。這些結果揭示了該蛋白在有色體發育中具有重要功能。通過果實轉錄組測序的結果及熒光定量PCR試驗證實ClPHT4;2基因是果實特異表達的轉運蛋白基因，且該轉運蛋白的轉錄水平在2個品種的果瓤變化上差異顯著。隨著‘97103果實的發育，該基因表達水平顯著提高，與授粉后10 d的果實相比，授粉后26 d果實中基因表達量提高了近250倍。而在‘PI296341-FR的果實發育中該基因一直維持在較低的表達水平?；虮磉_水平依賴于基因啟動子上游調控區的序列特征，比較2個品種該基因5上游1 500 bp調控區的堿基序列可以發現有20處單堿基變化。進一步研究發現，該基因啟動子區的順式調控元件在2個品種間存在顯著不同，由于SNP的變化使得‘97103基因啟動子序列中多出了2個ABRE及一個ERE結構域。這2種調控元件的產生意味著在‘97103中該基因可能受到更多信號的調控，我們認為順式調控元件的出現可以部分揭示‘97103品種中該基因表達水平迅速提高的原因。通過篩選控制ClPHT4;2基因在不同瓤色西瓜品種中差異轉錄的關鍵因子，得到了可以結合該ABRE結構域的2個候選bZIP類轉錄因子。此外還研究了糖分、ABA及乙烯途徑對果實瓤色發育的調控作用。

結? ? 論： 清晰系統地闡明了西瓜白瓤野生種進化到栽培種西瓜中有色體發育過程的異同;并且首次揭示了栽培西瓜后期大量有色體破裂形成番茄紅素小囊，是西瓜比番茄中的番茄紅素更容易吸收的一個重要原因;此外還發現了一個定位于有色體質膜中的磷轉蛋白基因的高量表達，是栽培西瓜瓤色形成的必要條件。針對該新發現的磷轉運蛋白基因的進一步研究表明，該基因可以被成熟相關因子如ABA、乙烯以及糖濃度所調控。該項研究為一步揭示激素及糖分信號調控果肉細胞有色體發育提供了重要的節點基因證據，為全面闡明果實有色體發育機制提供理論基礎。