比較基因組學在甜瓜白粉病抗病基因 Pm-2F連鎖標記開發中的應用

孫洪寶 許勇 張春秋

目的與意義：近年來隨著保護地甜瓜生產的迅速擴大，在高溫高濕的環境下，甜瓜白粉病的發生變得越來越嚴重，白粉病已經成為甜瓜綠色無公害生產的主要障礙，危害日益嚴重。研究發現，中國大部分地區的甜瓜白粉病菌由Podosphaera xanthii （P. xanthii）引起，其中小種2 France是主要的優勢生理小種。采用BSA法，開發與甜瓜白粉病P. xanthii 2F生理小種的抗性基因連鎖的系列分子標記，并實現精確定位。研究結果將為分子標記輔助甜瓜抗白粉病育種和甜瓜白粉病抗性基因克隆奠定基礎。

材料與方法：利用日本類型抗白粉病的甜瓜自交系‘K7-1為父本，新疆典型的哈密瓜感白粉病品種‘K7-2為母本，雜交獲得F1代，并建立了F2分離群體。從F2材料中隨機抽樣自交，通過單粒傳獲得重組自交系構成 RIL群體，共 106 個單系。采用孢子懸浮噴霧法進行抗白粉病苗期接種鑒定，在甜瓜基因組未知的情況下，利用黃瓜—甜瓜比較基因組結合BSA法將黃瓜對應區域的標記在甜瓜分離群體的抗感親本和抗感池進行多態性分析;并將篩選到的與甜瓜基因Pm-2F連鎖標記比較定位至黃瓜染色體，并利用黃瓜同源區域的分子標記和基因組序列信息，進一步開發與Pm-2F基因緊密連鎖的分子標記，通過多態性連鎖標記分析106個株系的RILs群體對Pm-2F基因進行定位;利用開發的緊密連鎖標記對甜瓜165份種質資源和13份鑒別寄主材料進行標記分析驗證標記的有效性。

結果與分析：通過對RIL分離群體的遺傳分析明確了‘K7-1對白粉病菌生理小種P. xanthii 2F的抗性由顯性單基因控制。利用甜瓜連鎖群的660對分子標記在抗感親本和抗感池中進行多態性篩選得到與抗性基因連鎖的多態性標記1對，分別是CMBR120和CMBR8，2個標記與目標基因的遺傳距離分別是0.9、1.9 cM。利用甜瓜—黃瓜比較基因組將以上2個與抗白粉基因Pm-2F連鎖標記序列與黃瓜基因組進行比對，發現該區段對應于黃瓜1號染色體上。進一步利用黃瓜1號染色體上已發表的136對SSR分子標記在抗感親本中進行多態性篩選，發現在抗感親本間有28對引物存在多態性，而這28對在抗感親本間具有多態性的分子標記中，僅有SSR02733、SSR027334和CS27在抗感池間具有多態性。在106個株系的RILs群體中驗證引物CS27、SSR02733、SSR02734、CMBR8、CMBR120的多態性。利用軟件JoinMap4.0繪制遺傳連鎖圖，將基因Pm-2F初步定位在LGⅡ上2.4 cM之間，兩側 翼標記為CMBR8和SSR02734（SSR02733）與Pm-2F的連鎖距離分別為0.5 cM和1.9 cM。

為進一步縮小Pm-2F基因目標區段的范圍，將上述具有多態性的標記序列比對到黃瓜基因組，發現所有標記序列在黃瓜1號染色體上均能找到同源區段，CMBR120、SSR02733、SSR02734和CMBR8標記在黃瓜染色體上的排列順序與甜瓜連鎖圖中的一致，而CS27標記在甜瓜連鎖圖上發生了重排。標記所定位目標區域覆蓋黃瓜基因組總長288 233 bp （Chr1 21 068 471-21 356 694）。對該區域的候選基因進行預測發現，目標區域共有49個基因，其中包括2個NBS-LRR類抗病基因（基因編號分別為Csa1M572370.1 和 Csa1M572380.1），并且這2個基因位于Pm-2F基因的2個側翼標記CMBR8和SSR02734之間，由此推斷Csa1M572370.1 和 Csa1M572380.1為Pm-2F的同源基因。

針對這上述2個抗病基因，參考黃瓜的基因序列進行設計特異引物，在甜瓜抗感親本中擴增產物唯一且長度為466 bp。在純合抗白粉病基因型DdeⅠ酶切后為359 bp和107 bp的條帶;雜合抗白粉病不能夠完全酶切，酶切后產生466 bp、359 bp、107 bp 3條帶;感病基因型由于沒有相應的酶切位點，因此酶切后仍為466 bp 1條帶。該標記與目標基因的遺傳距離為0.3 cM。利用該標記對甜瓜165份種質資源和13份鑒別寄主材料進行標記分析，發現在165份種質資源材料中標記分析基因型和表型的吻合率為97%，在13份鑒別寄主材料中僅有基因型和表型4份不吻合，其中有2份抗病材料的基因型與感病親本條帶一致，可能該材料中存在其他抗病基因。

結? ? 論： 確定了抗性材料‘K7-1對白粉病菌生理小種P. xanthii 2F的抗性由顯性單基因控制，將Pm-2F基因定位在0.8 cM的區間，兩側翼標記與目標基因的連鎖距離為0.5和0.3 cM，同時研究表明，利用黃瓜基因組可以成功地用于甜瓜標記的開發，比較基因組學為利用已測序模式植物的基因組開發近緣物種的分子標記提供了新的思路與方法。