西瓜果實發育過程中轉錄組的初析

郭紹貴 劉景安 鄭軼 黃明云 張海英 宮國義 何洪巨 任毅 鐘思林 費章君 許勇

目的與意義：目前關于西瓜果實在分子水平上發育和成熟的信息非常少，栽培西瓜是一種非呼吸越變型水果。到目前為止，只有一份報告描述了西瓜果實發育過程中一小部分基因的表達，對西瓜進行了大規模的轉錄組測序，以期對西瓜果實發育過程中的分子基礎有更多了解。

材料與方法：使用西瓜自交系‘97103作為試驗材料，在西瓜成熟過程中的白肉階段、粉肉、紅肉和過熟階段分別測序cDNA，進行cDNA序列處理、組裝、注釋和比較基因組學分析，鑒定西瓜差異表達的基因，測定糖、可溶性固形物和類胡蘿卜素的含量以及果肉硬度，qRT-PCR分析2個糖代謝基因。

結果與分析：通過使用焦磷酸測序技術對西瓜果實發育過程中4個階段的cDNA樣品進行測序。4個階段分別是：白肉階段（10 DAP），粉色果肉（18 DAP），紅色果肉（26 DAP）和過熟（34 DAP），獲得了總共577 023個高質量的EST，平均長度為302.8 bp，總長度為174.7 Mb。組裝了包括大約8 000個EST，這些ESTs分布在4 616個unigenes中，在454個深度轉錄組測序后962個unigenes（20.8%）未被捕獲。這表明盡管454個深度測序產生了大量新的 unigenes（超過70 000），但是只有將轉錄組測序到更深度的水平才能發現更多的稀有基因。

為了注釋西瓜轉錄組，使用BLASTX程序將單基因序列與NCBI非冗余（nr）蛋白質數據庫進行比較。分析顯示，41 245（54.9%），20 648（27.5%）和4 493（5.9%）的unigenes與已知蛋白質序列匹配。比較了西瓜unigenes與pfam域數據庫，總共11 454個水溶性unigenes含有至少一個由unigenes代表的pfam結構域和1 475個不同pfam結構域。發現465個unigenes含有轉錄因子的結構域，代表性最高的pfam轉錄因子結構域是PF00319、PF00847、PF00046和PF01486。然后將基因GO注釋到它們UniProt數據庫中的已知蛋白質，共有33 853個unigenes（45.1%）被分配至少一個GO注釋，其中在生物過程類別的28 987個（38.6%）被分配到至少一個GO注釋中，28 997個unigenes（38.6%）分配在分子功能類別中，細胞成分類別中有27 036（36%），而在所有3個類別中，21 779（29%）unigenes被指定為GO注釋。GO注釋揭示了大量基因參與碳水化合物代謝過程（1 807），解剖結構形態發生（1 687），細胞氨基酸和衍生物代謝過程（1 595），以及次級代謝過程（992）。

篩選了水溶性二烯，三-，四-，五-和六-核苷酸SSR堿基序列，并能夠預測4 668個西瓜unigenes的5 195個SSR，其中2 265、2 709、11 557和49個分別是二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR（簡單重復序列）基序。最常見的SSR基序是AG / CT（1 616; 31.1%），其次是AAG / CTT（1 300; 25%），AT/AT（519;10%）和AAT/ATT（465; 9%）。在本研究中確定的SSR標記提供給了西瓜重要的分子標記資源。然而，這些SSR的多態性需要在特定的群體中進行測試。

根據差異表達的基因分類為不同的類別：1）在西瓜成熟的4個階段中的每個階段都高度表達的基因; 2）在西瓜成熟早期階段高度表達的基因; 3）在西瓜成熟晚期高度表達的基因。蔗糖、果糖和葡萄糖，這3種糖類決定了果實的甜度和3種類胡蘿卜素（番茄紅素、β-胡蘿卜素和葉黃素）含量，這些類胡蘿卜素在果實著色中起關鍵作用（原圖5）。另外，通過數據分析發現許多細胞壁相關基因在未成熟的白色果實中有更高的表達，包括PRPs（富含脯氨酸的蛋白），阿拉伯半乳聚糖蛋白（FLAs），木葡聚糖內轉糖基酶（XETs）。在未成熟的白肉階段，由于番茄紅素開始的積累，西瓜果肉組織開始變成粉紅色。確定了在西瓜果實發育中4個階段3種主要胡蘿卜素、番茄紅素、β-胡蘿卜素和葉黃素的含量，結果顯示，番茄紅素是果實中的主要類胡蘿卜素。所得數據證實了糖代謝的大致趨勢，蔗糖占成熟果實中總可溶性糖的約50%，而未成熟和白粉色果肉中的果實含量為3%～7%。作者鑒定了在西瓜果實發育過程中差異表達的蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶，這2個基因參與蔗糖的生物合成，并在紅色果肉和過熟階段在果實中高度表達。

結? ? 論： 西瓜是一種重要的經濟水果作物，而且西瓜是非呼吸越變型水果的研究資源。但是西瓜的遺傳資源和基因組資源十分匱乏，這是西瓜研究和育種的主要限制性因素之一。上文中在西瓜4個不同的生長發育階段中使用焦磷酸測序技術獲得了大約50萬左右的ESTs，這些ESTs被de novo組裝并廣泛注釋，這代表了西瓜轉錄本目錄的擴展，為將來某些感興趣基因的功能和表達分析提供了全面的物質基礎。這些ESTs也將有助于注釋現階段正在測序的西瓜基因組，基因表達的數字化和代謝譜的綜合分析為進一步探索西瓜果實發育的分子機制和西瓜果實品質性狀的調控機制提供了新的思路。