基于DArT-Seq SNP的高密度遺傳圖譜的構(gòu)建及野生型和 栽培型西瓜雜交遺傳群體偏分離基因組區(qū)域的鑒定

任潤(rùn)生 李蘋(píng)芳 徐錦華 張曼 劉 廣 姚協(xié)豐 羊杏平

目的與意義： 西瓜[Citrullus lanatus （Thunb.） Matsum. et Nakai] 是重要的蔬菜作物，在全世界范圍內(nèi)都廣泛種植。構(gòu)建高密度的西瓜遺傳圖譜和不斷利用新開(kāi)發(fā)的標(biāo)記構(gòu)建飽和遺傳圖譜仍然是目前西瓜基因組學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。本項(xiàng)研究主要以西瓜自交系‘K3和野生西瓜種‘PI 189225為親本構(gòu)建F2分離群體，利用以DArTseq為基礎(chǔ)的SNP標(biāo)記構(gòu)建西瓜高密度遺傳連鎖圖譜。

材料與方法： （1）對(duì)苗期采集的母本、父本、F1、F2 單株幼嫩真葉2 g，真空干燥后，采用CTAB法進(jìn)行DNA提取。（2）依照Kilian 等（2012）的方法，用限制性?xún)?nèi)切酶PstI 和MseI 將其隨機(jī)打斷，根據(jù)酶切的接頭序列，采用帶有PstI和HpaII的接頭序列進(jìn)行連接并PCR擴(kuò)增。根據(jù)識(shí)別標(biāo)簽序列得到每個(gè)個(gè)體的測(cè)序reads，以西瓜97103為參考基因組序列進(jìn)行BLAST序列比對(duì)和數(shù)據(jù)過(guò)濾等獲得親本與群體的SNP基因型。（3）根據(jù)親本與群體的基因型，采用滑動(dòng)窗口法，即選擇以每15個(gè)SNP 為1個(gè)窗口，每次滑動(dòng)1個(gè)SNP，確定每個(gè)窗口的基因型以及每個(gè)個(gè)體的交換位點(diǎn)，得到每個(gè)個(gè)體的Bin基因型。（4）使用JoinMap4.1軟件，作圖法選擇maximum likelihood（ML）算法，作圖函數(shù)選擇Kosambis 函數(shù)構(gòu)建遺傳圖譜。各個(gè)染色體遺傳標(biāo)記圖譜采用軟件MapChart v2.2進(jìn)行作圖。

結(jié)果與分析： （1）采用DArTseq方法，共獲得了4 808個(gè)SNP標(biāo)記，這些標(biāo)記的平均得率為91.3%，PIC值為0.022～0.500，平均PIC值為0.454。根據(jù)SNP標(biāo)記剔除的標(biāo)準(zhǔn)，共有1 343個(gè)SNP標(biāo)記被剔除，剩余3 465個(gè)標(biāo)記（占總數(shù)的72.1%）用來(lái)組裝相應(yīng)的bin標(biāo)記。（2）利用滑動(dòng)窗口法和軟件JoinMap 4.1進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建，最終獲得包含1 161個(gè)bin標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，全長(zhǎng)1 099.2 cM，標(biāo)記間平均距離為2.16 cM。單個(gè)染色體長(zhǎng)度差異明顯，其中最短的7號(hào)染色體為61.8 cM，最長(zhǎng)的5號(hào)染色體為140.2 cM。單個(gè)染色體上的bin標(biāo)記數(shù)也差異明顯，其中bin標(biāo)記數(shù)最少的為7號(hào)染色體，共含有62個(gè)bin標(biāo)記;5號(hào)染色體為含有最多bin標(biāo)記的染色體，共含有160個(gè)bin標(biāo)記。平均每條染色體含有105.5個(gè)bin標(biāo)記。大部分bin標(biāo)記間的遺傳距離都小于5.0 cM，而01號(hào)染色體則有區(qū)間分別為5.5 cM和9.9 cM;03號(hào)染色體則有區(qū)間分別為6.2 cM和6.9 cM;10號(hào)染色體和11號(hào)染色體則有兩區(qū)間分別為5.4 cM和10.4 cM。整個(gè)染色體的物理長(zhǎng)度為330.6 Mb，平均物理長(zhǎng)度為30.0 Mb，最小的為04號(hào)染色體（24.3 Mb），而最長(zhǎng)的為9號(hào)染色體（35.0 Mb）。（3）研究結(jié)果顯示大部分染色體的遺傳圖譜和其物理圖譜之間的關(guān)系都一致，而只有11號(hào)染色體上大約有21.2 Mb的區(qū)段則不一致。除了遺傳圖譜和其物理圖譜之間的關(guān)系外，我們還通過(guò)比較遺傳距離（cM）和物理距離（Mb）之間關(guān)系，計(jì)算了每條染色體的重組頻率，結(jié)果顯示11條染色體的重組頻率差異較明顯，重組頻率最低的為7號(hào)染色體，為2.0 cM/Mb;而重組頻率最高的為5號(hào)染色體，為4.2 cM/Mb;而11條染色體的平均重組頻率為3.3 cM/Mb。（（4）卡方測(cè)驗(yàn)表明，1 161個(gè)bin標(biāo)記中，共有616個(gè)標(biāo)記（占53.1%）表現(xiàn)出顯著偏分離（P = 0.05）。其中513個(gè)標(biāo)記（占44.2%）偏向于西瓜優(yōu)良栽培品種K3，而103個(gè)標(biāo)記 （占8.9%）偏向于野生西瓜種質(zhì)‘PI189225。513個(gè)偏向于西瓜優(yōu)良栽培品種K3的標(biāo)記都分布于除6號(hào)染色體外的其他所有的染色體上;而103個(gè)偏向于野生西瓜種質(zhì)‘PI189225的標(biāo)記則主要分布于5個(gè)染色體上，分別為04號(hào)染色體上 2個(gè)標(biāo)記， 06號(hào)染色體上11個(gè)標(biāo)記， 07號(hào)染色體上16個(gè)標(biāo)記， 10號(hào)染色體上39個(gè)標(biāo)記以及 11號(hào)染色體上35個(gè)標(biāo)記。所有的這616個(gè)偏分離標(biāo)記在11條染色體上主要以成簇分布，共形成44個(gè)偏分離標(biāo)記區(qū)（Segregation distortion region，SDRs）。⑤通過(guò)對(duì)西瓜種質(zhì)‘97103和‘PI 296341-FR之間基因組序列的比對(duì)，在葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定出4 335 338 SNPs 和35 197 InDels。為了確定在本研究中的偏分離的標(biāo)記主要是由于西瓜栽培種和野生種之間基因組結(jié)構(gòu)的差異造成，根據(jù)每個(gè)標(biāo)記的物理位置，本研究將這些標(biāo)記（SNPs 和InDels）和偏分離的區(qū)域進(jìn)行比較分析，44個(gè)SDRs中共包含有2 289 215 SNPs 和18 023 InDels?？傮w上看來(lái)，位于染色體02， 04， 06， 07和09上的SDRs中的SNPs的密度（SNPs/Mb）多于位于其他非SDRs區(qū)域中或整個(gè)染色體。相反，位于染色體01， 03， 05， 08，10和11上的SDRs中的SNPs的密度（SNPs/Mb）則低于位于其他非SDRs區(qū)域中或整個(gè)染色體。同樣的趨勢(shì)也表現(xiàn)在InDels上。

結(jié) 論： 本研究中，筆者利用F2分離群體構(gòu)建了西瓜遺傳連鎖圖譜，根據(jù)遺傳圖譜的構(gòu)建方法以及所用的大量的SNP標(biāo)記，本高密度圖譜具有很高的可信度。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)遺傳圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)了存在有多個(gè)位于不同染色體上的偏分離區(qū)域，以及發(fā)現(xiàn)位于11號(hào)染色體上的一段區(qū)域，其遺傳位置和物理位置不一致，本研究也對(duì)這些現(xiàn)象都作了具體描述和分析。本研究所構(gòu)建的具有高密度和高可信度的遺傳圖譜將對(duì)西瓜基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，以及對(duì)我們更進(jìn)一步理解西瓜基因組結(jié)構(gòu)將提供重要的幫助。