中國華東地區西瓜甜瓜蔓枯病菌生物學鑒定和特性分析

李蘋芳 任潤生 姚協豐 徐錦華 羊杏平

目的與意義： 蔓枯病（Didymella bryoniae）是瓜類作物最重要的真菌性病害之一。近年來，隨著華東地區西瓜甜瓜種植面積的逐步擴大，種植也大面積重茬，致使各西瓜甜瓜種植區蔓枯病危害也逐年加重，嚴重制約了西瓜甜瓜產業的發展。本文對來源于華東地區不同種植區的西瓜和甜瓜蔓枯病病株上分離純化得到的蔓枯病原菌，通過從菌落形態、致病性、菌絲生長速度及產孢能力等生物學特性進行觀察和對病原菌的ITS序列進行了分析，進而對蔓枯病菌株進行了遺傳多樣性分析，并嘗試建立蔓枯病菌產孢體系和穩定有效的蔓枯病菌致病鑒定體系。

材料與方法： （1）對不同地區采集的發病組織在其病健交界處剪取4～5 cm長的組織，消毒后將組織塊置于PDA平板培養基上，25 ℃恒溫培養后挑取邊緣菌絲進行純化。純化后將分離的菌株接種新鮮黃瓜果皮進行分生孢子的誘導和形態鑒定。（2）病原菌致病力鑒定材料采用‘Sugarlee‘Sugarbaby‘Charleston3個西瓜品種，及‘通甜和‘珍珠2個甜瓜品種。在植株2片真葉時，采用孢子懸浮液（1×106CFU·mL-1）進行噴施接種，接種后覆蓋棚膜保濕3 d，溫度控制在25 ℃左右。于接種后1周采用九級病級法進行葉片發病情況統計。（3）采用rDNA-ITS擴增引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3′）進行病原菌核糖體RNA基因內轉錄間隔區（rDNA- ITS）序列的擴增和測序。將測得的病菌rDNA-ITS序列在GenBank中進行Blast比對，搜索同源性序列，進而根據本試驗菌株與GenBank中已鑒定菌株ITS序列的相似度，初步確定蔓枯病菌種類。此外，采用DNA star對蔓枯病菌的ITS序列進行比較，分析菌株間多態性。

結果與分析： （1）從中國華東地區收集的41個分離菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，所有分離菌株的基板菌絲體初為乳白色，但在4 °C下轉移至黑暗時，基板菌絲體變為橄欖綠或黑色同心圓，氣生菌絲發達。從菌落、氣生菌絲看沒有明顯的差異;后期基內菌絲形態略有差異。菌絲生長速度顯示出差異性，生長最快的JSHM-1達到1.87 cm·d-1，JSDY-1，JSDY-5，JSDY-6生長速度較慢，每天只有1 cm左右。（2）接種黃瓜果實后，大約1周后，在接種塊周圍可產生大量黑色的分子孢子器，通過顯微觀察，各菌系產生的孢子大小、形態基本一致為橢球型（花生豆形狀），以無色單胞或者雙胞為主，雙胞的2個細胞大小相等，分子孢子的平均長度和寬度大約為8 μm×3 μm，分子孢子的中間有輕微皺縮。（3）為了比較不同菌株的致病性差異，以西瓜感病材料‘Sugarlee‘Sugarbaby‘Charleston，及甜瓜感病材料‘通甜、中抗蔓枯病材料‘珍珠為試材進行蔓枯病菌致病力測定，每個材料接種10棵，3次重復，1周后統計發病情況，采用10級病情分級統計。綜合5個品種發病情況看，JXJJ-2，ZJNB-1，ZJNB-4，ZJNB-9，ZJNB-11，JSJY-2，JSJY-3，JSJY-4，JSJY-7，JSHM-1，JSHM-3，JSLH-1 12個菌株致病力較強，5個品種的病情等級均達到5以上。（4）為了進一步確認這些分離菌株為D. bryonia并揭示這些分離株之間的遺傳差異，通過引物對ITS1和ITS4（Genbank注冊號分別為KF38671和KF386611）對這些菌株的rDNA-ITS核苷酸序列（長度為545 bp）進行了分析。擴增產物的多重序列比對分析顯示，除了從浙江寧波和江蘇江陰分離出的13株甜瓜蔓枯菌株，其余菌株與NCBI數據庫中的D. bryoniae分離株有99%～100%的一致性。13個菌株與其余菌株的區別為在ITS-1區131位由鳥嘌呤替換為腺嘌呤的單核苷酸替換。通過和前人對蔓枯病原菌株的系統發育樹的結果比較，本研究所分離的蔓枯病菌屬于D. Bryonia RG I或RG II。通過結合其他Didymella種（包括D. Zeae Maydis、D. Exigua、D. Rabiei、D. Fabae和D. Applanata）的聚類分析，進一步確定本研究分離的蔓枯病菌株為D. bryoniae。

結? ? 論： 本研究對來自中國華東地區不同西瓜甜瓜寄主的GSB病原菌的鑒定和分析結果，將有助于我們在未來可通過選擇具有較高致病性的蔓枯病菌株進行西瓜甜瓜品種的抗性評價和抗病育種實踐中。